Efecto de extractos de cultivo sumergido de pleurotus ostreatus, pleurotus djamor y pleurotus agaves sobre la activación in vitro de macrófagos

RESUMEN Las especies del género Pleurotus son conocidas como hongos comestibles, de las cuales también se han reportado propiedades farmacológicas como anti-lipidémica y antiinflamatoria, debido a la presencia de estatinas y otros metabolitos bioactivos. Sin embargo, no todas las especies tienen estas propiedades y el potencial farmacológico de cepas mexicanas no ha sido reportado. Es por ello que, en este estudio realizamos el crecimiento biotecnológico de Pleurotus ostreatus cepa CP-50, P. djamor cepa P-50 y P. agaves cepa P-52, utilizando un sustrato no convencional, con el objetivo de evaluar la actividad antiinflamatoria de los metabolitos intracelulares y extracelulares, en un modelo in vitro. Los hongos fueron crecidos en medio de cultivo líquido usando un sustrato no convencional (BFL+C). Los pellets del cultivo fúngico fueron separados por filtración, la biomasa fue liofilizada y el medio líquido fue utilizado directamente para la extracción. En estas condiciones de crecimiento, la producción de biomasa seca fue 5.40, 4.94 y 4.27 g/L y la velocidad de crecimiento de 0.11, 0.13 y 0.10 horas-1, para P. ostreatus, P. djamor y P. agaves, respectivamente. La biomasa seca y el medio líquido fueron extraídos utilizando acetato de etilo como disolvente. Los ensayos de citotoxicidad fueron realizados para determinar las concentraciones seguras de los extractos, y se evaluó el efecto en la producción de NO, TNF e IL-6 en macrófagos estimulados con LPS a diferentes concentraciones, mediante la reacción de Griess o ELISA. La activación de NF-kB fue evaluada en los macrófagos de la línea celular RAW-Blue™. Los resultados fueron comparados con las células tratadas con indometacina. Finalmente, se realizó un perfil cromatográfico y análisis de RMN para comparar los metabolitos entre las diferentes cepas. Nosotros observamos que el extracto del medio líquido (ELM) de las tres especies fue citotóxico por arriba de los 50 μg/mL, mientras que el extracto del micelio (EM) fue citotóxico por arriba de 25 μg/mL para P. ostreatus, y arriba de 50 μg/mL para P. djamor y P. agaves. Por lo tanto, para los ensayos de actividad antiinflamatoria utilizamos concentraciones menores a esas, donde el EM de las tres cepas tuvo mayor efecto inhibitorio que ELM, en la producción de mediadores pro-inflamatorios. En este caso, las células tratadas con ELM de P. ostreatus y P. agaves redujeron la producción de NO, IL-6 y TNF a 50 μg/mL, pero los extractos de P. djamor no tuvieron efecto. Por Página | IX otro lado, EM de las tres especies redujo la producción de ON incluso a 3 μg/mL, y para TNF a 12.5 y 25 ug/mL. Para IL-6 sólo P. agaves redujo su secreción. Claramente, la activación de NF-kB fue drásticamente inhibida con todas las cepas evaluadas. El perfil cromatográfico de los extractos de acetato de etilo de P. ostreatus y P. djamor mostraron mayor similitud que P. djamor y, el análisis preliminar de RMN sugirió ácidos grasos como metabolitos mayoritarios. En conclusión, este trabajo confirmó el potencial uso de P. ostreatus como fuente de metabolitos antiinflamatorios, y por primera vez para P. agaves. Interesantemente, P. djamor presentó un diferente perfil metabólico y tuvo menos potencial antiinflamatorio.

ABSTRACT Species of the genus Pleurotus are known as edible mushrooms, but also it has been reported to have pharmacological properties such as anti-lipidemic and anti-inflammatory activities, associated to the presence of statins and other bioactive metabolites. However, not all Pleurotus species has these activities, and the pharmacological potential of Mexican strains has not been reported. Therefore, in this study we perform the biotechnological growth of Pleurotus ostreatus strain CP-50, P. djamor strain P-50 and P. agaves strain P-52, using a non-conventional source, with the objective to evaluate the anti-inflammatory activity of intracellular and extracellular secondary metabolites, in an in vitro model of macrophage activation. The mushrooms were grown in liquid culture medium using a non-conventional source (BFL+C). The pellets of the fungal culture were separated by filtration, the biomass was lyophilized and the liquid medium was used directly for extraction. In this conditions of growth, the production of dry biomass were 5.40, 4.94 and 4.27 g/L and the speed of growth were 0.11, 0.13 and 0.10 hour-1, for P. ostreatus, P. djamor and P. agaves, respectively. The dry biomass and the liquid medium were extracted using ethyl acetate as dissolvent. Cytotoxic assay were conducted to determine the safe concentrations of the extracts and the effect on NO, TNF e IL-6 production was evaluated in LPS-stimulated-macrophages at different concentrations by Griess reaction or ELISA. The activation of NF-kB was evaluated in the murine macrophage cell line RAW-Blue™. The results were compared with the cells treated with indomethacin. Finally, a chromatographic profile and RMN analyses were realized to compare metabolites between different strains. We observed that the extract obtained from liquid medium (LME) of the three strains were cytotoxic over 50 μg/mL, while the mycelium extracts (ME) were toxic over 25 μg/mL for P. ostreatus, and over 50 μg/mL for P. djamor and P. agaves. Thus, we used concentrations lesser of these concentrations for anti-inflammatory activity assays, where the ME of the three strains had more inhibitory effect than LME on production of the pro-inflammatory mediator In this case, the cells treated with LME from P. ostreatus and P. agaves reduced production of NO, IL-6 and TNF to 50 μg/mL, but extracts of P. djamor has not effect. By other hand, ME of the three strains reduced Página | XI ON even at 3 μg/mL and TNF production at 12.5 y 25 μg/mL. For IL-6 only P. agaves reduced their secretion. Notoriously, NF-kB activation was drastically inhibited with all strains tested. Chromatographic profile from ethyl acetate extracts of P. ostreatus and P. agaves showed more similarity than P. djamor, and the preliminary RMN assay suggest lipid acids as majority metabolites. In conclusion, this study confirmed the potential use of P. ostreatus as source of anti-inflammatory metabolites and for the first time for P. agaves. Interestingly, P. djamor presented a different metabolic profile and has a lesser anti-inflammatory potential.