Establecimiento de un cultivo de células en suspensión de carica papaya que expresa el péptido protector contra la cisticercosis ketc7 y evaluación de su actividad antiparasitaria

RESUMEN A partir de callos friables previamente adaptados en condición de oscuridad se establecieron cultivos de células en suspensión de Carica papaya: un cultivo silvestre (WT) y un cultivo transgénico C23 que expresa el péptido KETc7 de la vacuna contra la cisticercosis S3Pvac. Ambo cultivos crecieron en medio líquido B5 con los fitorreguladores ácido 2,4-diclorofenoxiacético y cinetina 2 mg L-1. Este estudio se realizó en dos etapas; en la primera se llevó a cabo la determinación de parámetros cinéticos: se estableció la cinética de crecimiento en matraz agitado con 6 % de inóculo por 42 días, se analizó la viabilidad celular, el pH del medio de cultivo, el consumo de azúcares totales, la concentración de proteína total y la cuantificación del péptido KETc7. Se determinó para C. papaya WT una velocidad de crecimiento de 0.05 d-1 y una biomasa máxima de 10.12 g L-1. La línea transgénica C23 presentó una µ igual a 0.10 d-1 y biomasa máxima de 14.36 g L-1. Considerando la capacidad antiparasitaria reportada de algunos componentes de la papaya, se analizó en una segunda etapa la actividad nematicida de los cultivos en suspensión contra el nematodo parásito H. contortus, el cual es de importancia en el área pecuaria. Los bioensayos se realizaron en placas de microtitulación de 96 pozos. Se utilizó una concentración de 1 mg/mL de la biomasa celular disuelta en PBS pH 7.4, como control negativo se utilizó el medio Hanks, y como control positivo Ivermectina 5 mg/mL. Se colocó un promedio de 100 larvas L4 sin vaina en cada pozo (n=6). Posteriormente se realizaron lecturas a las 72h. El análisis estadístico que se utilizó fue un diseño completamente al azar en el programa SAS V9. La incubación de la biomasa WT con larvas L4 de Haemonchus contortus indujo un porcentaje de mortalidad 17.52 al día 30 de crecimiento, mientras que la biomasa proveniente de la línea transgénica C23 de 44.59 a los 12 días de crecimiento, siendo estos últimos los porcentajes más altos. En este trabajo de tesis se establecieron cultivos de células en suspensión de papaya: uno no modificado y otro expresor del péptido KETc7, y se demostró la actividad nematicidad de los mismos. Como perspectivas del presente estudio se propone determinar los valores CL50 y CL90, y continuar con un fraccionamiento biodirigido de la biomasa celular, para purificar y elucidar las moléculas responsables de la actividad nematicida contra parásitos de importancia pecuaria.

ABSTRACT Using callus growing under darknesse condition the establishment of suspension cell cultures of Carica papaya: wild type (WT) and the C23 transgenic line that expresses the KETc7 of the vaccine againt cysticercosis S3Pvac. Both lines grew in liquid B5 medium added with the phytoregulators 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and kinetin 2 mg L-1. This study was carried out in two stages; in the first stage of the kinetics parameters was carried out, as well as cell viability, pH of the culture medium, consumption of total sugars, total protein concentration, and quantification of the KETc7 peptide. A maximum growth velocity of 0.05 d1 and a maximum biomass of 10.12 g L-1 were determined for C. papaya WT. The transgenic line C23 showed a μ 0.10 d-1 and a maximum biomass of 14.36 g L-1. The nematicidal activity against the parasite H. contortus was analyzed in the second stage, which is important in the livestock area. The bioassays were performed in 96-well microtiter plates. A concentration of 1 mg/mL of the biomass dissolved in PBS pH 7.4, was used the Hanks medium as a negative control, and the positive control Ivermectin 5 mg/ml. An average of 100 larvae without pod were placed in each well (n = 6). Seventy-two hours, readings were made. The SAS V9 program was used for the statistical analysis using a random desing. The incubation of the WT biomass with L4 larvae of Haemonchus contortus induced a mortality percentage of 17.52 at day 30 of growth, whereas the biomass from the C23 transgenic line presented 44.59% at 12 days of growth, being these percentages highest. In the present work cell suspensions cultures of wild type papaya and KETc7 peptide expressors were established and their nematicidal activity were demonstrated. The perspectives of the present study are to determine the LC50 and LC90 lethal concentrations and to continue with the bioguided fractionation of cell biomasses in order to purify and elucidate the molecules responsibles for the nematicidal activity against parasites of livestock importance.