Caracterización estructural mediante RMN, de la toxina OspTx2b proveniente de la anémona Oulactis sp.

RESUMEN Las toxinas extraídas de animales terrestres como escorpiones, serpientes, arañas y anfibios, así como las aisladas de animales marinos, tales como medusas, anémonas, serpientes de mar, peces, conus, etc. han sido estudiadas con mayor interés en los últimos años, debido a la gran variedad de proteínas y péptidos que contienen, que han mostrado un efecto potente en diversos sistemas1 . En el presente trabajo se describen las características específicas de las toxinas de anémonas, así como su clasificación principal: neurotoxinas y citolisinas. Por ser OspTx2b y BcsTx1 neurotoxinas, se redunda más sobre la función de las neurotoxinas en canales de Potasio. Algunas neurotoxinas provenientes de anémonas han mostrado tener efectos en canales de Potasio Kv1.3. Estos canales están asociados a la proliferación de células T, que pueden desencadenar enfermedades autoinmunes tales como: psoriasis y esclerosis múltiple. En la metodología, se describen las toxinas con las que se trabajaron: OspTx2b proveniente de la anémona Oulactis sp., una especie endémica de las costas de Australia y BcsTx1 procedente de anémona Bunodosoma caissarum, endémica de Brasil. Se puntualiza el procedimiento para la producción de BcsTx1 de forma recombinante y para OspTx2b de forma sintética, así como el procedimiento de la purificación de cada una, para llegar a la obtención de la muestra adecuada para continuar con los estudios de RMN. Algunos resultados, como en el caso de BcsTx1, no fueron favorables a pesar de realizar cambios en diversos parámetros, para la optimización de la producción del péptido recombinante. Por el caso contrario, no se observaron mayores problemas al trabajar con OspTx2b. Sin embargo, inesperadamente OspTx2b no mostró tener actividad en canales de Potasio como sus homólogas ShK y BgK, pero este estudio revela que además de ciertos aminoácidos, la disposición espacial de los residuos es importante para la unión de la toxina y el canal. En este trabajo, se determinó la estructura tridimensional de OspTx2b por RMN. Mientras que para la toxina BcsTx1 de la anémona Bunodosoma caissarum, que tiene un 54% de identidad con OspTx2b, por lo que, teóricamente la estructura sería similar, no se pudo determinar la estructura tridimensional.

ABSTRACT Peptide toxins from scorpions, snakes, spiders and amphibious, as well as, marine animals like jellyfish, sea anemones, sea snake, fishes and conus have come into increasing use in studies of the various ion-channels controlling membrane excitability and secretion, and have proved the means by which some of the active proteins have been purified and analyzed the last years. Methodology section describes toxins that we studied OspTx2b and BcsTx1 from different sea anemone. Oulactis sp. is an endemic sea anemone from Australia. In a transcriptomic study on Oulactis sp., was identified a 36-residue peptide, OspTx2b, containing a ShK/BgK-like cysteine framework, with high sequence similarity to BgK. OspTx2b was obtained by chemical synthesis. BcsTx1 is a toxin that belongs to Bunodosoma caissarum an endemic sea anemone from Brazil, BcsTx1 obtained by recombinant technique. Additionally, this section shows procedures to obtain the NMR sample to structural studies. Results chapter shows the solution structure of OspTx2b. OspTx2b structure was determined using nuclear magnetic resonance spectroscopy. OspTx2b possesses a BgK-like scaffold with the same disulfide bond connectivity. However, OspTx2b doesn’t have activity against the Kv channels assessed in this study implies that the ShK/BgK scaffold is capable of supporting functional activity beyond potassium channel blockade, also OspTx2b showed no growth inhibitory activity against several strains of bacteria and fungi. On other hands, BcsTx1 was produce by expression system. Unfortunately, the expression was very inconsistent, although, we tried different host, vector, temperature, media concentration and expression time to optimized expression. NMR results showed that BcsTx1 could be random coil and electrophysiology results did not show strong activity against the K channel compare to native toxin. Elucidation of chemical structures is imperative of mechanisms of actions but also for designing proper countermeasures such as detection, determination and therapeutic methods. In summary, we determinate OspTx2b tridimensional structure by NMR spectroscopy. We cannot obtain BcsTx1 structure, due to recombinant peptide obtained exhibit random coil behavior. However, BcsTx1 has 54% sequence identity to OspTx2b; therefore, BcsTx1 structure could be similar to OspTx2b.