Establecimiento de cultivos de callos y células en suspensión a partir de ageratina pichinchensis (asteraceae) para la producción de metabolitos secundarios bioactivos

RESUMEN Ageratina pichinchensis es una planta medicinal utilizada en el estado de Morelos como antifúngica, cicatrizante y gastroprotectiva, cuenta con estudios científicos que han validado sus usos populares. Estos efectos biológicos hacen que la planta sea una fuente importante de compuestos bioactivos, lo que ha conducido a considerar esta especie en peligro de extinción debido al interés de los colectores de hierbas y plantas medicinales. En atención a este problema, se requiere generar sistemas sustentables para la obtención de los compuestos bioactivos, en este sentido la biotecnología vegetal mediante el cultivo de tejidos y células en suspensión ha brindado alternativas viables para la obtención de metabolitos secundarios. En este proyecto se establecieron cultivos in vitro de callos y células en suspensión productores de compuestos antiinflamatorios y cicatrizantes de la especie A. pichinchensis, para ello se utilizaron semillas colectadas en el campo donde crece la planta, después del proceso de desinfección se sembraron bajo condiciones de esterilidad en medio de cultivo MS y se incubaron bajo condiciones controladas de luz y temperatura (25±2 °C y 16 h luz/8 h oscuridad), transcurridas 72 h de incubación se logró una germinación del 98% y posteriormente fueron transferidas a frascos de vidrio tipo Gerber con el mismo medio de cultivo. Se utilizaron hojas de plántulas de un mes de edad como fuente de explante y se expusieron en medio MS suplementado con diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento vegetal [KIN (0.1 mg L-1) con: ANA, 2,4-D y picloram (0.1 y 1.0 mg L-1 para cada RCV)]. Se monitoreó la respuesta morfogenética durante 30 días y se determinó por gravimetría la friabilidad de los callos obtenidos y el perfil metabólico a partir de sus extractos orgánicos en AcOEt y MeOH, los resultados mostraron que la combinación que mejor respuesta presentó fue KIN con ANA, por lo que se llevó a cabo un segundo abanico hormonal en el que se utilizaron 4 niveles de concentración con ambos RCV (0.0, 0.1, 1.0 y 2.0 mg L-1), los resultados mostraron la inducción de tres respuestas morfogenéticas (callo, callo/raíz, raíz) encontrándose que el tratamiento más apropiado para inducir a callos friables fue KIN (0.1 mg L-1) y ANA (1.0 mg L-1). Las células en suspensión se establecieron a partir de callos friables de 20 días de edad, para ello se cultivaron 5 g de callos frescos en 50 mL de medio de cultivo líquido contenido en matraz Erlenmeyer de 250 mL, su cinética de crecimiento mostró un comportamiento sigmoideo con una fase de latencia durante los primeros 4 días, la fase exponencial implicó los días 4-16 obteniendo la acumulación de biomasa máxima el día 16 (13.28 ± 0.4855 g/L), la velocidad específica de crecimiento (µ) fue de 0.2303 días-1 y el tiempo de duplicación (td) fue de 3.01 días, en los días 18 y 20 se observó la fase estacionaria y a partir del día 22 la fase de muerte, el perfil metabólico de los puntos de la cinética mostró que la producción de compuestos sucede durante toda la cinética, sin embargo la acumulación de metabolitos ocurrió el día 18 (fase estacionaria). Se identificaron 11 compuestos en los cultivos in vitro de callos, mismos que fueron reproducidos por los cultivos de células en suspensión, dos de estos compuestos (uno de tipo benzofurano y un triterpeno) presentaron importante efecto antiinflamatorio, mientras que el benzofurano además presentó efecto cicatrizante, por lo tanto, los cultivos in vitro de callos y células en suspensión son sistemas viables para la producción de compuestos bioactivos. Cabe señalar que se identificó por primera vez el efecto antiinflamatorio del compuesto benzofurano y podría considerarse un agente antiinflamatorio debido a que tiene el potencial de inhibir la activación de NF-β, NO, IL-6 y la secreción de TNF, es decir suprime la expresión de los genes diana NF-β como la sintasa de óxido nítrico inducible (iNOS) y la vía proinflamatoria. Respecto al estudio fitoquímico de la planta silvestre se identificaron 13 compuestos, de los cuales el compuesto de tipo flavonoide mostró un efecto importante como antiinflamatorio y su benzocromeno y acetofenona promovieron la cicatrización en heridas de ratones de 2 mm, este resultado sugiere que la especie A. pichinchensis produce compuestos antiinflamatorios y cicatrizantes al igual que sus cultivos in vitro.

ABSTRACT Ageratina pichinchensis is a medicinal plant used in the state of Morelos as antifungal, healing and gastroprotective, has scientific studies that have validated its popular uses. These biological effects make the plant an important source of bioactive compounds, which has led to consider this species in danger of extinction due to the interest of the collectors of herbs and medicinal plants. In response to this problem, it is necessary to generate sustainable systems for obtaining bioactive compounds, in this sense plant biotechnology through the cultivation of tissues and cells in suspension has provided viable alternatives for obtaining secondary metabolites. In this project, in vitro cultures of callus and cells in suspension producing antiinflammatory and cicatrizing compounds of the species A. pichinchensis were established. For this, seeds collected in the field where the plant grows were used, after the disinfection process they were sown under conditions of sterility in MS culture medium and were incubated under controlled conditions of light and temperature (25 ± 2 ° C and 16 h light / 8 h dark), after 72 h of incubation a germination of 98% was achieved and subsequently they were transferred to Gerber type glass jars with the same culture medium. One-month-old seedling leaves were used as a source of explant and were exposed in MS medium supplemented with different combinations of plant growth regulators [KIN (0.1 mg L-1) with: ANA, 2,4-D and picloram (0.1 and 1.0 mg L-1 for each RCV)]. The morphogenetic response was monitored for 30 days and the friability of the corns obtained and the metabolic profile from their organic extracts in AcOEt and MeOH were determined by gravimetry, the results showed that the combination that presented the best response was KIN with ANA, What was done was a second hormonal range in which 4 levels of concentration were used with both RCV (0.0, 0.1, 1.0 and 2.0 mg L-1), the results showed the induction of three morphogenetic responses (callus, callus / root, root) found that the most appropriate treatment to induce friable calluses was KIN (0.1 mg L-1) and ANA (1.0 mg L-1). Suspended cells were established from friable calluses of 20 days of age, for which 5 g of fresh calli were cultured in 50 mL of liquid culture medium contained in 250 mL Erlenmeyer flask, their growth kinetics showed sigmoidal behavior with a latency phase during the first 4 days, the exponential phase involved days 4-16 obtaining the maximum biomass accumulation on day 16 (13.28 ± 0.4855 g / L), the specific growth rate (μ) was 0.2303 days-1 and the doubling time (td) was 3.01 days, on days 18 and 20 the stationary phase was observed and from day 22 the death phase, the metabolic profile of the kinetic points showed that the production of compounds happen throughout the kinetics, however the accumulation of metabolites occurred on day 18 (stationary phase). Eleven compounds were identified in the in vitro cultures of callus, which were reproduced by cell cultures in suspension, two of these compounds (one of the benzofuran and one triterpene type) had an important anti-inflammatory effect, while benzofuran also had a cicatrising effect, therefore, in vitro cultures of callus and cells in suspension are viable systems for the production of bioactive compounds. It should be noted that the antiinflammatory effect of the benzofuran compound was identified for the first time and could be considered an anti-inflammatory agent because it has the potential to inhibit the activation of NF-β, NO, IL-6 and TNF secretion, ie it suppresses the expression of the NF-β target genes such as inducible nitric oxide synthase (iNOS) and the proinflammatory pathway. Regarding the phytochemical study of the wild plant, 13 compounds were identified, of which the flavonoid-type compound showed an important anti-inflammatory effect and its benzocromen and acetophenone promoted wound healing in 2-mm mice, this result suggests that species A. pichinchensis produces anti-inflammatory and healing compounds as well as its in vitro cultures.