Expresión del anticuerpo scFv 6009F en las cepas KM71 y GS115 en Pichia pastoris usando el plásmido pPICZAα

Los alacranes provocan picaduras en los seres humanos, siendo niños y ancianos los más susceptibles y en quienes se presentan los síntomas más graves. Las picaduras por alacrán representan un problema sanitario por la toxicidad de sus venenos, ya que producen reacciones como parálisis muscular que afecta la movilidad y la visión, causando convulsiones pudiendo llegar a provocar paro respiratorio y cardíaco que terminan en muerte (Pastrana et al., 2003). En este trabajo se usaron dos cepas de P. pastoris GS115 y KM71 transformadas con el plásmido pPICZAα/6009F. El plásmido es de expresión extracelular ya que contiene el péptido señal de excreción α de S. cerevisiae. Se verifico la construcción mediante secuenciación del plásmido pPICZAα/6009F con oligonucleótidos específicos para el plásmido pPICZAα. A la secuencia obtenida se le realizo un BLAST los resultados indicaron que el gen de interés tiene un 100% de similitud con la secuencia depositada en el Genebank del scFv 6009F. Una vez verificada la construcción, se obtuvieron las transformantes de P. pastoris GS115/pPICZAα/6009F y KM71/pPICZAα/6009F que fueron seleccionadas mediante resistencia a Zeocina. Usando cultivos de P. pastoris GS115 pPICZAα/6009F y KM71/ pPICZAα/6009F en matraces bafleados de 500 ml con 50 ml de medio BMMY, a tres diferentes temperaturas de incubación 26, 28 y 30° C y a dos velocidades distintas de agitación 150 y 250 rpm. Se obtuvo la proteína soluble en el sobrenadante del medio de cultivo en ambas expresiones de las cepas P. pastoris KM71 y GS115. El medio se centrifugo a 7,200 rpm para obtener el sobrenadante, éste fue concentrado, dializado y purificado en columna de níquel y se visualizó la proteína correspondiente al scFv 6009F en geles de SDS-Page y por Western blot con anti-His. Lo anterior confirmo la producción del scFv 6009F de manera extracelular y soluble por el sistema de expresión en Pichia pastoris. Sin embargo, a las condiciones de expresión de 250 rpm y 30 °C la proteína se obtiene glicosilada en P. pastoris GS115, pPICZAα/6009F, el tamaño de la banda es mayor al esperado de 28 kDa. Empleando 250 rpm y 28 °C en la expresión P. pastoris GS115, pPICZAα/6009F, se observó la proteína en el gel de SDS, de un tamaño de aproximadamente 26 kDa lo que sugiere que no tiene el tag de His+, lo que se comprobó en el Western blot ya que no se observó reconocimiento de la banda, lo que sugiere que el tag de His+ no está accesible o fue cortada de la proteína. Para ambas construcciones P. pastoris GS115 y KM71 pPICZAα/6009F la mejor condición de expresión fue usando 150 rpm y 26 °C, debido a que la proteína se obtiene de con un peso molecular de 28 kDa y fue reconocida en el Western Blot por el anti His+. La proteína fue cuantificada durante el proceso de purificación y se obtuvieron 40 mg/L usando ambas construcciones es decir en P. pastoris GS115 y KM71. El scFv 6009 obtenido en la P. pastoris GS115, pPICZAα/6009F reconoce la toxina Cn2, y los venenos de C. noxius y C. limpidus, mediante ensayos de Elisa usando concentraciones 1:10 veneno: anticuerpo y el reconocimiento fue detectado mejor usando el tag de c-myc que con el His+. Para P. pastoris KM71 pPICZAα/6009F, se está evaluando la concentración de proteína final y el reconocimiento.