Relevancia de residuos de lisina únicos en la superficie de lac3 diseñados para futuros procesos de funcionalización y oxidativos

Las lacasas fúngicas son oxidorreductasas con baja especificidad de sustrato. La funcionalización de la superficie de lacasa se utiliza para obtener catalizadores híbridos con nuevas propiedades. Los residuos de aminoácidos como la lisina que están expuestos en la superficie, pueden ser fácilmente funcionalizados a través de alquilación reductora. En este trabajo, LAC3-K0, una enzima desprovista de lisina, se utilizó como plataforma para detectar posibles sitios expuestos en la superficie adecuados para ser reemplazados por un residuo de lisina relevante para futuros estudios de funcionalización. Se seleccionaron siete sitios de un modelo 3-D LAC3-K0 a distintas distancias del sitio CuT1 en donde el sustrato interactúa con la enzima y se obtuvieron variantes de lisina únicas (UNIKn, n = posición del residuo) mediante mutagénesis dirigida al sitio. Las variantes, incluidas aquellas con mutaciones adicionales (que afectan a residuos de superficie) obtenidas al azar, se expresaron en Saccharomyces cerevisiae W303-1A y se detectaron como proteínas secretadas funcionales, por su capacidad para oxidar guaiacol o 2,2'-azino-bis (3- etilbenzotiazolina-6- ácido sulfónico (ABTS) en placas de agar. Todas las variantes fueron activas a pH ácido y se mantuvieron estables a temperaturas entre 15 y 55 °C. Los ensayos de oxidación revelaron que el reemplazo de uno o dos residuos de superficie afectó en gran medida la actividad enzimática y la selectividad del sustrato independientemente de la distancia al sitio CuT1. Se encontró que los parámetros catalíticos (Kmapp y Kcatapp) determinados con ABTS eran diferentes entre las variantes. Se determinó que el papel de los parches hidrofóbicos detectados en la superficie de LAC3-K0 era un factor a considerar en la interacción de los materiales híbridos. Todas las variantes con lisina de ubicación única en superficie, creadas en este trabajo pueden ser demandadas para obtener lacasas con cierta especificidad de sustrato en el diseño de materiales híbridos.