Evaluación de la preferencia de la HSL BaEstB sobre el 2-naftil acetato vs p-nitrofenil acetato mediante parámetros cinéticos

La prospección y caracterización de enzimas generan información relevante para obtener alternativas que otorguen mayor eficiencia catalítica para la producción de compuestos orgánicos interesantes. Las enzimas lipolíticas bacterianas (lipasas y esterasas) presentan actividades de síntesis y/o hidrólisis de una amplia variedad de sustratos esterificados. En el laboratorio de Biología Molecular de Hongos se realizó la caracterización bioquímica de una esterasa HSL que fue aislada a partir de una librería de cDNA del hongo Basidiomiceto Bjerkandera adusta crecido en petróleo crudo, la cual fue denominada BaEstB. Se demostró que tiene una preferencia por cadenas acilo 2C, sin embargo, su actividad se reduce hasta 18 veces frente al p-NPA, e incluso muestra regioselectividad inclinada por el 2-NA que para 1-NA. Entonces se propuso que la especificidad pudiera verse influenciada por la parte alcohol del sustrato. Posteriormente, se demostró a través de estudios in silico y de HPLC que esta enzima es capaz de hidrolizar el ergoesteroil-acetato. Además, a partir de un análisis de “docking” se determinó que las líneas mutantes (Y81S y L211W) son capaces de utilizar sustratos de cadena acilo mayor a 2C, como ha sido demostrado por la enzima ortóloga RmEstB del hongo mucoral Rhizomucor miehei. En este proyecto se logró la inducción de la BaEstB wt y de las líneas mutantes a las 72 h. Dada la notable preferencia de la BaEstB wt por el 2- NA, se utilizó para determinar el valor de Km que fue de 20 uM y una velocidad de 1x10-6 umol/min. Es importante comparar la actividad de la BaEstB wt y sus líneas mutantes a determinada concentración del ergosteroil acetato, 1-NA, 2-NA y p-NPA y poder dilucidar la preferencia entre estos sustratos, e incluso establecer una correlación con los residuos de aminoácidos que se encuentran en el túnel de entrada al sitio activo. Esto permitiría una caracterización completa, evaluando tanto sustratos comerciales como naturales, y podría darnos indicios de si el ergosterol acetilado es su sustrato celular. Este estudio pone en perspectiva la necesidad de evaluar la especificidad de este tipo de enzimas en sustratos no convencionales como los esteroles esterificados y los alcoholes terciarios. Por lo que hipotetizamos que la HSL BaEstB será una enzima que podría ser utilizada para la obtención de compuestos orgánicos interesantes.

ABSTRACT Enzyme prospection and characterization can generate relevant information that could obtain alternatives that provide greater catalytic efficiency. for the production of interesting organic compounds. Bacterial lipolytic enzymes (lipases and esterases) they present activities of synthesis and/or hydrolysis of a wide variety of esterified substrates. The biochemical characterization of an HSL esterase was made in the Laboratory of Molecular Biology of Fungi; was isolated from a cDNA library of the fungus Basidiomycete Bjerkandera adusta grown in crude oil, which was named BaEstB. It was shown to prefer 2C acyl chains; however, its activity is reduced to 18-fold against p-NPA, and it even shows inclined regioselectivity for 2- NA than for 1-NA. It was proposed the alcohol part of the substrate could be influenced by the specificity. Subsequently, through in silico and HPLC studies this enzyme was shown the capacity of hydrolyzing ergosteroyl-acetate. In addition, from a docking analysis it was determined that the mutant lines (Y81S and L211W) are capable of using substrates with an acyl chain reater than 2C, as has been demonstrated by the orthologous enzyme RmEstB of the mucoral fungus Rhizomucor miehei. In this project, the induction was achieved of BaEstB wt and of the mutant lines at 72 h. Given the notable preference of wt BaEstB for 2-NA, it was used to determine the value of Km which was 20 μM and a rate of 1x10-6 μmol/min. It is important to determine the activity of BaEstB wt and its mutant lines at a certain concentration of ergosteroyl acetate, 1-NA, 2-NA and p-NPA, in order to compare them and be able to elucidate the preference between these substrates, and even establish a correlation with the amino acid residues found in the entry tunnel to the active site. Thus, its characterization would be more complete, since commercial and natural substrates are evaluated, resolving whether ergosterol fulfills a physiological role. This characterization could be a guideline to explore the specificity in unconventional substrates such as esterified sterols and tertiary alcohols. Proposing BaEstB as a candidate or one of its mutant lines as alternatives for obtaining interesting organic compounds.