Caracterización bioquímica y molecular de proteínas GroEL con actividad insecticida provenientes de bacterias simbiontes

RESUMEN Las chaperonas moleculares o proteínas de choque térmico, son una amplia familia de proteínas sin relación que han sido caracterizadas principalmente por sus funciones vitales para la célula como son: asistencia del plegado proteico, mantenimiento de la integridad del proteoma y la proteostasis (homeostasis proteica). Una de la subfamilia mejor caracterizada han sido las proteínas Hsp60 o también referidas a ellas como chaperoninas 60 (GroEL en el caso de bacterias). Estas proteínas forman un complejo en forma de doble anillo que se encargan principalmente de asistir el plegamiento de proteínas mal plegadas o que no han alcanzado su estado nativo, estas chaperonas requieren también la asistencia de una co-chaperonina Hsp10 (GroES) para su correcto funcionamiento. Genes que codifican para estas proteínas han sido identificados en todos los genomas bacterianos secuenciados hasta la fecha, existiendo diferencias en cuanto al número de copias entre los diferentes grupos que existen, así como entre miembros del mismo grupo. Un hallazgo hecho varias décadas atrás fue el descubrimiento de funciones alternativas para estas proteínas, consideradas hoy en día como proteínas “moonlighting”. Aunque ya han sido caracterizadas varias funciones alternativas para estas proteínas como son activadores de la respuesta inmune en mamíferos (activación de monocitos y macrófagos), formación del biofilm en bacterias, función como adhesina, función como tirosin-cinasa entre otras. Quizá, una de las actividades más sorprendentes y recientemente descubiertas de los miembros de esta familia ha sido la de ejercer actividad tóxica en contra de eucariontes. Tal es el caso de una proteína proveniente de Enterobacter aerogenes, que es una bacteria que muestra una asociación simbiótica con insectos del género Myrmeleon, esta proteína mostró actividad tóxica sobre cucarachas del género Blatella germanica al ser inyectada en el hemocele, y que al ser caracterizada fue identificada como una proteína GroEL. Estudios aún más recientes demuestran la actividad insecticida de estas proteínas identificadas como GroEL provenientes de bacterias simbiontes del género Xenorhabdus, asociadas específicamente a nemátodos entomopatógenos del género Steinernema, y cuando fueron evaluadas mostraron ser tóxicas contra larvas de Spodoptera frugiperda y Galleria mellonella. Algo que resulta interesante es el hecho que todas estas proteínas son provenientes de microorganismos con algún tipo de asociación simbiótica. En nuestro laboratorio se han aislado diversas bacterias provenientes de nematodos entomopatógenos, y donde el estudio de éstas proteínas no ha sido reportado hasta ahora. Con base en lo expuesto anteriormente, este trabajo tuvo como objetivo analizar y caracterizar bioquímica y molecularmente la actividad tóxica de estas proteínas en contra de insectos y si esta actividad se encuentra estrechamente relacionada con el estilo de vida de estas bacterias. Además, otro punto a evaluar es si estas proteínas pueden ser consideradas como moonlighting, es decir conservar su actividad canónica como chaperona y a su vez ejercer la función de toxina. Primeramente, nuestros resultados mostraron que sólo tres bacterias fueron patógenas y altamente virulentas Pseudomona aeruginosa NA04, Photorhabdus luminescens HIM3 y Xenorhabdus nematophila SC 0516 cuando fueron evaluadas células completas, extracto proteico del sobrenadante y el extracto proteico intracelular ejerciendo un efecto dosis dependientes en todos los casos . Sin embargo, cuando fue evaluada la actividad insecticida de las proteínas GroEL de las diferentes cepas sobre larvas de G.mellonella, únicamente aquella proveniente de X.nematophila llamada GroELXn mostró una actividad estadísticamente significativa en comparación con sus ortólogos, la DL50 para esta proteína fue de 102.35 ng/larva. Así mismo, la proteína GroELXn mostró la mayor actividad tóxica cuando las proteínas fueron evaluadas por vía oral en dieta artificial sobre larvas neonatas de S.frugiperda, obteniendo una DL50 de 17.56 μg/g de dieta. Cuando se evaluó la actividad chaperonina de las proteínas mediante el ensayo de replegamiento de la enzima LDH, no se detectaron diferencias significativas entre las proteínas GroEL, indicando que todas pueden llevar a cabo la función canónica de chaperona molecular. Los resultados sugieren que GroELXn es capaz de llevar a cabo ambas funciones, pudiendo ser considerada una proteína moonlighting. Como parte de las observaciones en el cambio del fenotipo de las larvas al ser inyectadas con la proteína GroELXn, decidimos evaluar la actividad profenoloxidasa, lo cual arrojó que GroELXn es capaz de activar fuertemente este sistema cuando es inyectada en el hemocele de los insectos, en comparación con GroELAf, con la menor actividad insecticida presentando diferencias altamente significativas. Por último, el análisis de las secuencias proteicas arrojó que las diferencias puntuales entre una u otra proteína se encuentran dispersas a lo largo de la cadena polipeptídica y no en un dominio particular. También el análisis mostró que la secuencia con una relación más estrecha a GroELXn fue la proveniente de P.luminescens HIM3 denominada GroELPl difiriendo en 35 aminoácidos, mientras que la que muestra un mayor grado de divergencia es GroELAf con 155 sustituciones diferentes.

ABSTRACT Molecular chaperones, or heat shock proteins, are a large family of unrelated proteins that have been characterized primarily for their vital cellular functions such as assisting protein folding, maintaining proteome integrity and proteostasis (protein homeostasis). One of the best characterized subfamily has been the Hsp60 proteins or also referred to as chaperonins 60 (GroEL in the case of bacteria). These proteins form a complex in the form of a double ring that is mainly responsible for assisting the folding of misfolded proteins or proteins that have not reached their native state, these chaperones also require the assistance of an Hsp10 co-chaperonin (GroES) for proper function. Genes encoding for these proteins have been identified in all bacterial genomes sequenced to date, with differences in copy number among the different groups that exist, as well as among members of the same group. A finding made several decades ago was the discovery of alternative functions for these proteins, considered today as "moonlighting" proteins. Although several alternative functions for these proteins have already been characterized, such as activators of the immune response in mammals (activation of monocytes and macrophages), biofilm formation in bacteria, function as adhesin, function as tyrosine kinase, among others. Perhaps one of the most surprising and recently discovered activities of the members of this family has been that of exerting toxic activity against eukaryotes. Such is the case of a protein from Enterobacter aerogenes, which is a bacterium that shows a symbiotic association with insects of the genus Myrmeleon, this protein showed toxic activity on cockroaches of the genus Blatella germanica when injected into the hemocele, and when characterized it was identified as a GroEL protein. Even more recent studies demonstrate the insecticidal activity of these proteins identified as GroEL from symbiont bacteria of the genus Xenorhabdus, specifically associated with entomopathogenic nematodes of the genus Steinernema, and when evaluated were shown to be toxic against larvae of Spodoptera frugiperda and Galleria mellonella. Interestingly, all these proteins are from microorganisms with some kind of symbiotic association. In our laboratory, several bacteria have been isolated from entomopathogenic nematodes, and the study of these proteins has not been reported so far. Based on the above, the objective of this work was to analyze and characterize biochemically and molecularly the toxic activity of these proteins against insects and whether this activity is closely related to the lifestyle of these bacteria. In addition, another point to evaluate is whether these proteins can be considered as moonlighting, i.e. retain their canonical chaperone activity and at the same time exert the toxin function. Firstly, our results showed that only three bacteria were pathogenic and highly virulent Pseudomona aeruginosa NA04, Photorhabdus luminescens HIM3 and Xenorhabdus nematophila SC 0516 when whole cells, supernatant protein extract and intracellular protein extract were evaluated exerting a dose-dependent effect in all cases. However, when the insecticidal activity of the GroEL proteins of the different strains on G. mellonella larvae was evaluated, only the one from X. nematophila called GroELXn showed a statistically significant activity in comparison with its orthologues, the LD50 for this protein was 102.35 ng/larva. Likewise, the GroELXn protein showed the highest toxic activity when the proteins were evaluated orally in artificial diet on neonate larvae of S.frugiperda, obtaining a LD50 of 17.56 μg/g diet. When the chaperonin activity of the proteins was evaluated by LDH enzyme refolding assay, no significant differences were detected among the GroEL proteins, indicating that all can perform the canonical molecular chaperone function. The results suggest that GroELXn is capable of carrying out both functions and can be considered a moonlighting protein. As part of the observations on the change in the phenotype of larvae when injected with GroELXn protein, we decided to evaluate the prophenoloxidase activity, which showed that GroELXn is able to strongly activate this system when injected into the hemocoel of insects, compared to GroELAf, with the lowest insecticidal activity presenting highly significant differences. Finally, the analysis of the protein sequences showed that the point differences between one or the other protein are dispersed along the polypeptide chain and not in a particular domain. The analysis also showed that the sequence with the closest relationship to GroELXn was the one from P.luminescens HIM3 called GroELPl differing by 35 amino acids, while the one showing the highest degree of divergence was GroELAf with 155 different substitutions.