Evaluación de la actividad sobre las enzimas ptp-1b y a-glucosidasas de la especie croton ehrenbergii

RESUMEN. El género Croton (Euphorbiaceae) cuenta con un importante número de especies, las cuales son utilizadas para el tratamiento de diversos padecimientos, incluyendo la diabetes. Existen reportes sobre algunas especies de este género, que han documentado su efecto antidiabético, el cual ha sido atribuido a diversos compuestos, principalmente flavonoides. Sin embargo, algunas otras especies, como es el caso de C. ehrenbergii, no cuentan con reportes sobre la determinación de su actividad antidiabética, ni de la seguridad de su uso después de una administración por vía oral. En el presente trabajo se estudió el extracto hidroalcohólico de C. ehrenbergii, con la finalidad de determinar su potencial antihiperglucémico e insulinosensibilizador, así como su toxicidad oral aguda. Con la finalidad de determinar el contenido metabólico del extracto, se realizó una bipartición, obteniendo las fracciones de CH2Cl2, AcOEt, BuOH y el residuo acuoso y, a partir de procesos cromatográficos convencionales y del análisis de datos espectroscópicos y espectrométricos, se logró determinar que la fracción de CH2Cl2 está constituida principalmente por b-sitosterol y el flavonoide 7, 4’-di-O-metilnaringenina, así como otros metabolitos minoritarios; por su parte, la fracción de AcOEt se caracterizó por presentar abundantemente flavonoides, como tilirósido, rutina, nicotiflorina e isoquercetina; mientras que pinitol es el metabolito mayoritario de la fracción de BuOH y del residuo acuoso. Por otro lado, para evaluar el efecto antihiperglucemiante mediante la inhibición de las enzimas a-glucosidasas, se realizó un ensayo in vitro, el cual permitió determinar que la fracción de AcOEt inhibe de forma moderada la actividad enzimática (41.70 ± 1.06%), mientras que el extracto hidroalcohólico y las fracciones de CH2Cl2, BuOH y el residuo acuoso, no presentaron un efecto significativo (p< 0.05). RESUMEN. “Evaluación sobre la actividad de las enzimas PTP-1B y a-glucosidasas de la especie Croton ehrenbergii” 3 El efecto mostrado por la fracción de AcOEt se atribuye principalmente a tilirósido, metabolito mayoritario de esta fracción, pues al ser evaluado, tuvo un efecto similar al de la fracción total (37.84 ± 1.67 %). Adicionalmente, se realizaron curvas de tolerancia a sacarosa, administrando una dosis de 100 mg/Kg del extracto y sus fracciones. La fracción de AcOEt, contrariamente a lo observado en el ensayo in vitro, no presentó una actividad significativa, al igual que el extracto hidroalcohólico y la fracción de CH2Cl2; mientras que la fracción de BuOH y el residuo acuoso inhibieron significativamente el pico hiperglucémico (p< 0.05) generado tras la administración de la sacarosa, presentando un comportamiento similar al del fármaco de referencia. Este efecto se atribuye a pinitol, metabolito mayoritario de las dos muestras de prueba. Por otra parte, para determinar el efecto insulino-sensibilizador mediante la inhibición de la enzima PTP-1B, se llevó a cabo un ensayo in vitro, en el cual se observó que tanto el extracto hidroalcohólico como sus fracciones presentaron una actividad significativa (p< 0.05) al ser comparados con el vehículo. La fracción de BuOH presentó la mayor actividad, con un porcentaje de inhibición de 82.070 ± 0.004%. Por su parte, las fracciones de CH2Cl2 y AcOEt, cuyo contenido metabólico es abundante en flavonoides, presentaron porcentajes de inhibición de 72.421 ± 0.004 y 78.645 ± 0.001%, respectivamente. El ensayo permitió además sugerir que el efecto mostrado por la fracción de AcOEt se debe a la presencia de tilirósido, pues al ser evaluado, el flavonoide inhibió la actividad enzimática con un 83.433 ± 0.001%. Mientras que el flavonoide 7, 4’-di-O-metilnaringenina, obtenido de la fracción de CH2Cl2, inhibe la actividad de PTP-1B con un 40.599 ± 0.001%. RESUMEN. “Evaluación sobre la actividad de las enzimas PTP-1B y a-glucosidasas de la especie Croton ehrenbergii” 4 Finalmente, para determinar el grado de toxicidad del extracto hidroalcohólico, se realizó un estudio de toxicidad oral aguda, siguiendo las especificaciones descritas en la guía 420 de la OECD, en el cual el extracto mostró una baja toxicidad, y de acuerdo con lo observado a lo largo de todo el ensayo, se pudo clasificar dentro de la categoría 5 del GHS. De este modo, la presente investigación permite documentar el contenido metabólico de C. ehrenbergii y además, proporciona información sobre su potencial antidiabético, el cual puede deberse más a un efecto insulino-sensibilizador mediante la inhibición de la enzima PTP-1B, que a un efecto antihiperglucemiante. Asimismo, permite documentar la seguridad del uso de su extracto hidroalcohólico tras una única administración por vía oral

ABSTRACT. Croton genus (Euphorbiaceae) is constituted by significant number of species, some of them are frequently used in traditional medicine to treat a variety of illness, including diabetes. There are several reports about antidiabetic effect from some species of this genus, which has been attributed to flavonoids. However, some species such as C. ehrenbergii does not have reports about their antidiabetic activity or safety after oral administration. Therefore, is considered important to conduct research on these no studied species that to obtain information about its biological activity and safety. In this work, hydroalcoholic extract from C. ehrenbergii was studied in order to evaluate its antihyperglycemic and insulin sensitizer potential as well as its acute toxicity. In order to determine the metabolic content of the extract, a bipartition was done, obtaining the CH2Cl2, AcOEt and BuOH fractions, as well as aqueous residue. Conventional chromatographic processes and analysis of spectroscopic and spectrometric data, allowed to determine that CH2Cl2 fraction is composed of b-sitosterol and flavonoid 7, 4’-di-Omethylnaringenin, as well as other minor compounds. While AcOEt fraction was constituted mainly by flavonoids, including tiliroside, rutin, nicotiflorin and isoquercetin. And finally, pinitol was the major compound in BuOH fraction and aqueous residue. On the other hand, with the aim to evaluate the antihyperglycemic effect, an in vitro assay through the inhibition of α-glucosidase enzymes was performed. From the assay, AcOEt fraction shown moderately enzymatic inhibition activity (41.70 ± 1.06%), while hydroalcoholic extract as well as CH2Cl2, BuOH fractions and aqueous residue did not show a significant effect (p< 0.05). The effect showed by AcOEt fraction is mainly attributed to tiliroside, major compound in this fraction, since it was evaluated, shown similar effect to the total fraction (37.84 ± 1.67%). ABSTRACT. “Evaluación sobre la actividad de las enzimas PTP-1B y a-glucosidasas de la especie Croton ehrenbergii” 7 Additionally, sucrose tolerance curves were performed, administering a dose of 100 mg / Kg of the extract and its fractions. AcOEt fraction did not shows significant activity, contrary to the observed in vitro, but neither hydroalcoholic extract nor CH2Cl2 fraction. BuOH fraction and aqueous residue displayed a significant inhibition in the hyperglycemic peak (p< 0.05) generated after sucrose administration, presenting a similar behavior to that of the reference. On the other hand, to determine the insulin-sensitizing effect an in vitro assay was carried out through the inhibition of the PTP-1B enzyme. In this assay both hydroalcoholic extract and its fractions showed significant activity (p< 0.05) compared with vehicle. BuOH fraction presented the highest activity, with an 82.070 ± 0.004 percent of inhibition. On the other hand, CH2Cl2 and AcOEt fractions, whose metabolic content is abundant in flavonoids, displayed 72.421 ± 0.004 and 78.645 ± 0.001 percent of inhibition, respectively. Assay also suggested that the effect shown by AcOEt fraction is due to the presence of tiliroside, since it was evaluated, and this flavonoid inhibited enzyme activity in 83.433 ± 0.001%. While flavonoid 7, 4’-di-O-methylnaringenin, obtained from CH2Cl2 fraction, inhibits the PTP-1B activity in 40.599 ± 0.001%. Finally, to determine the degree of toxicity of the hydroalcoholic extract, an acute oral toxicity study was carried out, in which the extract showed low toxicity, classifying it within category 5 of the GHS. Thus, present research allows report the metabolic content of C. ehrenbergii, and provides information about its antidiabetic potential, which may be due more to an insulin-sensitizing effect by the PTP-1B inhibition, to an antihyperglycemic effect. Likewise, it allows document the safety