Genómica comparativa de nueve cepas del patógeno Anaplasma marginale e identificación de posibles candidatos vacunales contra la Anaplasmosis bovina en México

RESUMEN Anaplasma marginale es una bacteria intraeritrocítica y es el principal agente etiológico de la anaplasmosis bovina. Los signos clínicos de la enfermedad son: anemia hemolítica, fiebre, pérdida de peso, pérdida en la producción de leche, abortos, ictericia, e incluso la muerte súbita de los bovinos si los medicamentos no se aplican de manera oportuna. Este patógeno se distribuye ampliamente en todo el mundo, principalmente en las regiones tropicales y subtropicales del planeta. Actualmente, no existe una vacuna contra la anaplasmosis bovina a nivel mundial. Una alternativa para prevenir esta enfermedad es mediante el diseño de vacunas que están basadas en la información genómica. Sin embargo, solamente se han reportado genomas de cepas americanas (Estados Unidos), australianas, brasileñas y puertorriqueña de A. marginale en la base de datos GenBank. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo es identificar los péptidos o proteínas con potencial inmunogénico para el control de la anaplasmosis bovina en México, mediante el análisis de genómica comparativa entre nueve cepas mexicanas de A. marginale. En este trabajo se reportó que el DNA genómico de las cepas MEX-15-099-01 (Texcoco, Estado de México) y MEX-31-096-01 (Tizimín, Yucatán) contenía información genómica adicional de otros patógenos, los cuales se reportaron como Mycoplasma wenyonii INIFAP02 y ‘Candidatus Mycoplasma haemobos’ INIFAP01, respectivamente. Además, los genomas de las cepas MEX-07-068-01 (Pichucalco, Chiapas) y MEX-28-037-02 (Soto la Marina, Tamaulipas) mostraron una superinfección de diferentes cepas de A. marginale y fueron excluidos de los análisis genómicos posteriores. Por otra parte, los borradores de genomas de siete cepas mexicanas fueron ensamblados con una elevada calidad, entre 32 y 46 contigs con una longitud total de ~1.16 Mb, un contenido G+C de ~49.7% y una cobertura de ensamblaje mayor de 19X. Los borradores de genomas de las siete cepas mexicanas fueron depositados en la base de datos GenBank. La estructura de repetidas de MSP1a de cinco cepas mexicanas no coincidieron con las estructuras reportadas en la literatura. Estos errores pueden disminuir considerablemente mediante la secuenciación masiva de los genomas y no solamente del gen msp1a. La anotación automática de los borradores de genomas de las siete cepas mexicanas obtuvo entre 1,138 y 1,178 CDS. Además, los siete borradores de genomas contienen una copia de los tres genes rRNAs y 37 genes tRNAs. El análisis filogenético del genoma core de 24 genomas de A. marginale, mostró que: las cepas MEX-01-001-01 (Aguascalientes, Aguascalientes), MEX-30-184-02 (Tlapacoyan, Veracruz) y MEX-31-096-01 (Tizimín, Yucatán) están altamente relacionadas con cepas de la región de Norteamérica; las cepas MEX-14-010-01 (Atitalaquia, Hidalgo), MEX-15-099-01 (Texcoco, Estado de México) y MEX-30-193-01 (Veracruz, Veracruz) están altamente relacionadas con cepas de la región de Sudamérica; y la cepa MEX-17-017-01 (Puente de Ixtla, Morelos) está altamente relacionada con cepas de la región de Asia. El análisis pangenómico entre las siete cepas mexicanas reveló que el genoma core contiene 883 genes, mientras que este valor disminuye a 534 genes al utilizar los 24 genomas de A. marginale. La genómica comparativa mostró que los genomas de A. marginale están altamente conservados con valores de identidad mayores del 98%. Por último, 12 posibles candidatos vacunales fueron identificados. Estos candidatos vacunales están presentes en las siete cepas mexicanas, no muestran homología con las proteínas de eucariotas, tienen una localización subcelular en la membrana externa y de manera extracelular, son antígenos protectores y contienen una amplia variedad de epítopos de tipo B con longitudes entre 10 y 25 aminoácidos. Además, se identificaron 47 epítopos de tipo B de los 12 posibles candidatos vacunales que pueden ser utilizados para el diseño de MAPs (Multiple Antigenic Peptides) como una alternativa para el diseño de vacunas contra la anaplasmosis bovina en México.

ABSTRACT Anaplasma marginale is an intraerythrocytic bacterium and is the main etiological agent of bovine anaplasmosis. The clinical signs of the disease are: hemolytic anemia, fever, weight loss, loss of milk production, abortions, jaundice, and even sudden death in cattle if medications are not applied in a timely manner. This pathogen is widely distributed throughout the world, mainly in the tropical and subtropical regions of the planet. Currently, there is no vaccine against bovine anaplasmosis worldwide. An alternative to prevent this disease is through the design of vaccines based on genomic information. However, only genomes from American (United States), Australian, Brazilian, and Puerto Rican strains of A. marginale have been reported in the GenBank database. Therefore, the objective of this work is to identify peptides or proteins with immunogenic potential for the control of bovine anaplasmosis in Mexico, through comparative genomic analysis of nine Mexican strains of A. marginale. In this work, it was reported that the genomic DNA of the MEX-15-099-01 (Texcoco, Estado de México) and MEX-31-096-01 (Tizimín, Yucatán) strains contained additional genomic information of other pathogens, which were reported as Mycoplasma wenyonii INIFAP02 and 'Candidatus Mycoplasma haemobos' INIFAP01, respectively. In addition, the genomes of MEX-07-068-01 (Pichucalco, Chiapas) and MEX-28-037-02 (Soto la Marina, Tamaulipas) strains showed a superinfection of different strains of A. marginale and were excluded from the next genomics analyses. On the other hand, the draft genomes of seven Mexican strains were assembled with a high quality, between 32 and 46 contigs with a total length of ~1.16 Mb, a G+C content of ~49.7% and an assembly coverage greater than 19X . The draft genomes of the seven Mexican strains were deposited in the GenBank database. The repeats structure of MSP1a of five Mexican strains did not coincide with the structures reported in the literature. These errors can be considerably reduced by massive sequencing of genomes and not only of the msp1a genes. Automatic annotation of the draft genomes of the seven Mexican strains obtained between 1,138 and 1,178 CDS. Furthermore, the seven draft genomes contain one copy of the three rRNAs and 37 tRNAs. Phylogenetic analysis of the core genome of 24 A. marginale genomes showed that: MEX-01-001-01 (Aguascalientes, Aguascalientes), MEX-30-184-02 (Tlapacoyan, Veracruz) and MEX-31-096 -01 (Tizimín, Yucatán) strains are highly related to strains from the North America region; MEX-14-010-01 (Atitalaquia, Hidalgo), MEX-15-099-01 (Texcoco, Estado de México) and MEX-30-193-01 (Veracruz, Veracruz) strains are highly related to strains from South America region; and MEX-17-017-01 (Puente de Ixtla, Morelos) strain is highly related to strains from Asian region. The pangenomic analysis among the seven Mexican strains revealed that the core genome contains 883 genes, while this value decreases to 534 genes when using the 24 genomes of A. marginale. Comparative genomics showed that A. marginale genomes are highly conserved with identity values greater than 98%. Finally, 12 potential vaccine candidates were identified. These vaccine candidates are present in the seven Mexican strains, do not show homology with eukaryotic proteins, have a subcellular location in the outer membrane and extracellularly, are protective antigens, and contain a wide variety of B-type epitopes with lengths between 10 and 25 amino acids. In addition, 47 type B epitopes of the 12 possible vaccine candidates were identified that can be used for the design of MAPs (Multiple Antigenic Peptides) as an alternative for the design of vaccines against bovine anaplasmosis in Mexico.