Expresión del anticuerpo scfv 6009f con el vector phil-s1 en pichia pastoris gs115 y km71

Resumen Las moléculas de anticuerpos diseñados y sus fragmentos se explotan cada vez más como herramientas científicas y clínicas, existen diferentes tipos de fragmentos de anticuerpos que se pueden obtener mediante proteólisis, tal es el caso de los scFv que poseen ventajas sobre las inmunoglobulinas completas por su fácil difusión en el organismo, la neutralización especifica en el sitio blanco y su rápida eliminación, por lo que se han creado fragmentos anticuerpos recombinantes contra venenos de animales considerados como una alternativa para producir nuevos antivenenos para el tratamiento de picaduras de escorpión, ya que el escorpionismo se considera un problema de salud pública, reportando a nivel mundial 1.5 millones de casos por año, por lo que se espera que el fragmento de anticuerpos de cadena sencilla “scFv 6009F” que reconoce 6 toxinas de escorpiones del género Buthidae destacando la toxina Cn2 de Centruroides noxius es considerado como el más peligroso para México. El objetivo de este trabajo es la expresión heteróloga del scFv 6009F en la levadura Pichia pastoris empleando el plásmido pHIL-S1 para evaluar el rendimiento de producción sin perder la capacidad neutralizante hacia la toxina Cn2 y el veneno del escorpión Centruroides noxius. Se utilizaron las cepas de E. coli TOP10F para la transformación, clonación y propagación de pSyn1 y pHIL-S1 y las cepas de Pichia pastoris GS115 (HIS4, Mut+) y KM71 (HIS4, Muts). Se utilizo como control E. coli TG1/pSym scFv6009F y se obtuvieron las construcciones en Pichia pastoris GS115/pHIL-S1 scFv 6009F y KM71/pHIL-S1 scFv 6009F. Se expresó el fragmento de anticuerpo scFv 6009F, cultivando todas las cepas. Las construcciones en P. pastoris se cultivaron en medio BMMY a 28°C, hasta alcanzar una Abs595 = 2.0 nm. Se indujo la producción del scFv 6009F con metanol al 0.5% cada 24 h por 4 días, tomando muestras de 1 ml cada 6 h, éstas muestras fueron analizadas mediante SDS-PAGE y Western blot, se confirmó la presencia de bandas de 28 kDa correspondientes al scFv 6009F, que además coincide con el PM del scFv 6009F obtenido en E. coli TG1 lo que sugiere que los scFv 6009F obtenidos en P. pastoris con este plásmido no están glicosidados. Se purifico por cromatografía en columnas de níquel y se cuantificaron las muestras para de la cepa GS115 P. pastoris pHIL-S1/6009F se obtuvieron 90 mg/L y para 2 cepa KM71 pHIL-S1/6009F un total de 81 mg/L, es decir P. pastoris GS115 produce un 10 % más de proteína que P. pastoris KM71. Por último, se evaluó el reconocimiento del scFv 6009F producido en P. pastoris GS115 contra la toxina Cn2 de Centruroides noxius y en veneno completo de Centruroides lipimdus mediante la técnica de ELISA, usando en anti His+ y el Anti Myc para revelar. Este anticuerpo presento un mejor reconocimiento con el anti Myc que con el anti His+, lo que puede deberse a la forma en como está disponible dicho epítope en el anticuerpo scFv 6009F. Finalmente, este anticuerpo fue capaz de reconocer a la toxina Cn2 y el veneno completo de Centruroides noxius y Centruroides limpidus en una relación molar 1:10. Hace falta evaluar el fragmento scFv 6009F expresado en P. pastoris KM71.