Evaluación de los efectos antimicrobianos de combinaciones de péptidos cortos y antibióticos

RESUMEN El uso excesivo e incorrecto de los antibióticos, ha causado un incremento en la incidencia de infecciones bacterianas ocasionadas por cepas resistentes a su acción, como consecuencia de esta problemática ha surgido la necesidad de identificar y desarrollar agentes antimicrobianos novedosos, que permitan el control de la multirresisitencia a los antibióticos. Los peptidos antimicrobianos (PAMs), son moléculas naturales o sintéticas que se han propuesto como una alternativa prometedora para el desarrollo de nuevos antibióticos. Debido a que presentan características como un amplio espectro de actividad antimicrobiana, sobre bacterias Gram negativas y Gram positivas, hongos, parásitos y virus; adicionalmente a diferencia de los antibioticos convencionales los PAMs presentan multiples blancos de accion en las celulas bacterianas, inclyendo la disrupción de la membrana plasmática o interfiriendo con procesos como la sintesis de la pared celulrar, ADN, ARN y proteínas como los más importantes, por los PAMs pueden ejercer sus efectos bactericidas de forma directa o actuar como adyuvantes y potenciadores de otras moléculas antibióticas. La combinación de antibióticos con peptidos antimicrobianos puede potenciar su espectro antimicrobiano respecto a su uso por separado. En el veneno de diferentes animales, como los arácnidos, se han identificado una gran variedad PAMs, un ejemplo de estas moléculas, es el péptido denominado Css54 proveniente del alacrán Centruroides suffusus suffusus, este péptido tiene una longitud de 25 aminoácidos y un peso molecular de 2,870.4 Da, presenta actividad antibiótica de amplio espectro, efectos hemolíticos sobre eritrocitos humanos y la capacidad de potenciar los efectos de antibióticos comerciales. En un trabajo previo mediante ingeniería de proteínas y síntesis química se generaron dos péptidos cortos (14 y 15 aminoácidos), a partir de la secuencia del péptido Css54 con actividades bactericidas sobre E. coli y S. aureus, en este trabajo se evaluó el efecto de estos péptidos cortos en combinación con antibióticos, esto para poder potenciar sus efectos antimicrobianos sobre cepas bacterianas de interés clínico como E. coli y S. aureus. Primero se realizó la verificación de las cepas de S. aureus ATCC 25923 y E. coli ATCC 25922, lo cual nos dio como resultado que se encontraban puras. Se evaluó la susceptibilidad de cada cepa con diferentes antibióticos, mediante la técnica de Kirby-Bauer de acuerdo con lo estipulado por el CLSI. De acuerdo a lo esperado, debido a que son cepas de colección ATCC, ambas cepas bacterianas fueron sensibles a los antibióticos probados (Ampicilina, Cefotaxima, Gentamicina, Cefepime, Levofloxacina, Sulfametoxazol/ Trimetoprima y Tetraciclina). Este ensayo nos ayudó para elegir los antibióticos para realizar las X combinaciones con los dos péptidos cortos. El antibiótico seleccionado fue Ampicilina que tiene como blanco de acción, la pared celular. Los dos péptidos cortos de Css54 se purificaron a homogeneidad por HPLC y se identificaron por espectrometría de masas, el péptido Css54[15E]+4 presentó un PM de 2009.5 Da, mientras que el péptidoCss54[14]+5 un PM de 1880.4 Da. Una vez que se purificaron los péptidos, se cuantificaron y se llevaron a diferentes concentraciones, para evaluarlos con las dos cepas; y obtener las CMIs, mediante el método de dilución en líquido. El péptido Css54[15E]+4 presentó una CMI de 25 μM con S. aureus y una CMI de 50 μM con E. coli, mientras que el péptido Css54 [14]+5 presentó valores de CMI de 25 y 12.5 μM con S. aureus; y una CMI de 50 μM con E. coli. Posteriormente se realizó un ensayo en líquido para determinar las CMI del antibiótico a diferentes concentraciones en ambas cepas, Ampicilina presentó una CMI de 2.6925μM (1μg/ml) con S. aureus y una CMI de 6.7314μM (2.5μg/ml) con E. coli. Por último, se realizaron las combinaciones del péptido Css54 [15E]+4 y Ampicilina, para evaluarlas en ensayos por el método en líquido. Estas combinaciones fueron evaluadas en E. coli ATCC 25922, obteniendo como resultado que los efectos inhibitorios eran menores, a los obtenidos cuando estos trabajan por separados. También se realizaron combinaciones del péptido Css54 [14]+5 y Ampicilina; la cuales, fueron evaluadas en S. aureus ATCC 25923 y E. coli ATCC 25922. Los efectos que se observaron fueron menores a los obtenidos cuando el péptido y Ampicilina trabajan por separado, es decir, se obtuvo efectos antagónicos. Por lo que en trabajos posteriores se evaluará el potencial antimicrobiano de estas variantes en combinación con antibióticos con blancos de acción intracelulares de comerciales sobre bacterias multirresistentes a los antibióticos, ya que nuestras variantes cortas en combinación con ampicilina no pueden potenciar sus efectos, pero con otros antibióticos si podría tener efectos potenciadores. Tal es el caso de La47 que en combinación con ampicilina tiene efectos antagónicos, mientras que, con Cloranfenicol, Estreptomicina y Kanamicina presentó efectos potenciadores.