Evaluación in vitro del efecto inflamatorio de adipocitocinas en células mononucleares derivadas de sangre periférica, así como la asociación de sus niveles circulantes con la actividad clínica de pacientes con artritis reumatoide

RESUMEN La Artritis Reumatoide es una enfermedad autoinmune e inflamatoria, que incrementa significativamente la morbilidad y qué si no es tratada adecuadamente, posiblemente ocasionará discapacidad y deterioro en la calidad de vida del paciente. A pesar de que esta enfermedad se conoce desde hace muchos años, debido a su etiología multifactorial, es muy difícil poder precisar el conjunto de elementos necesarios para desencadenar el proceso autoinmune y/o su cronicidad. Por todo ello es de gran importancia aportar nuevo conocimiento orientado en la elucidación de los mecanismos que pudieran intervenir en el desarrollo de esta enfermedad. Por otro lado, estos últimos años, las moléculas producidas por el tejido adiposo, conocidos como adipocitocinas, parecen jugar un papel muy importante, no sólo en la regulación del metabolismo energético del individuo, sino que también en influir de manera significativa en el control de procesos patológicos inflamatorios. Dentro de ellas, las moléculas de leptina, adiponectina (Acrp30) y resistina, son una clara influencia en la regulación inmunológica, sin embargo, no se ha caracterizado de manera sistemática sus efectos comparativos sobre las células de sangre y, en particular, linfocitos T CD4+. Asimismo, aunque se ha propuesto que los niveles circulantes de las adipocitocinas podrían jugar un efecto sobre el desarrollo y estado clínico de los pacientes con AR, no se conoce su asociación con citocinas pro-inflamatorias ni con la actividad clínica de pacientes mexicanos. Objetivos: Caracterizar el efecto in vitro de las adipocitocinas sobre la respuesta celular (proliferación, activación, inducción de citocinas, diferenciación y muerte celular) en células mononucleares de sangre periférica de donadores y pacientes con Artritis Reumatoide, así como evaluar la asociación entre los niveles circulantes de adipocitocinas y la actividad clínica de pacientes con AR. Metodología: Se emplearon pacientes con AR, de acuerdo con los criterios ACR/EULAR, 2010, que asistieron al Hospital General de Cuernavaca y se determinó la actividad clínica (DAS28). También se emplearon muestras VIII sanguíneas de donadores del CETS-Morelos. Las células mononucleares (CMN) derivadas de sangre periférica fueron aisladas por la técnica de Ficoll-Paque y el aislamiento de células T CD4+ se realizó con perlas magnéticas Los ensayos in vitro fueron realizados con leptina y Acrp30 humanas recombinantes. El efecto proliferativo y de activación fueron evaluados por la técnica de MTT y la expresión de los marcadores CD25 y CD69, se realizó por citometría de flujo. Los niveles de IL-2 y TNFα en los sobrenadantes de cultivo, así como los niveles de adipocitocinas en plasma (leptina, Acrp30 y resistina), fueron evaluados por ELISA. La resistencia a la apoptosis inducida por etopósido fue evaluada por Yoduro de Propidio. La expresión de STAT3 y RORT fue evaluada por la técnica de Western Blot. Se empleó estadística analítica, empleando medias y desviación estándar para la descripción. Para la comparación entre grupos se empleó la prueba de Mann-Whitney y para el análisis de correlación se empleó la prueba de Spearman, considerando una p<0.05 como significativa. Resultados: Al evaluar la capacidad, por inducción de las adipocitocinas se logró observar un efecto proliferativo tanto en las células de donadores como de pacientes con AR y, en células derivadas del último grupo de individuos, se pudo observar una correlación estadística entre la actividad de la enfermedad y la proliferación inducida por leptina y Acrp30. Por otro lado, y de manera interesante, las CMN derivadas de los pacientes mostraron una respuesta mayor al ser incubadas con las adipocitocinas in vitro, ya sea en base a sus marcadores de activación (CD25, CD69, receptor de leptina, pSTAT3), así como la secreción de citocinas proinflamatorias (IL-1β, IL-2, IL-6 and TNF); en comparación con las CMN de los donadores. Adicionalmente, se observó que la secreción de IL-2 inducida por la incubación de leptina con CMN de pacientes correlacionó significativamente con la actividad clínica. Así también en los ensayos de muerte celular, se observó que la incubación con leptina o Acrp30 parecen “rescatar de la apoptosis” inducida por el tratamiento con etopósido. Por otro lado, y apoyo a nuestra propuesta de la existencia de una relación funcional entre leptina y el fenotipo Th17, observamos en IX nuestro sistema in vitro que la incubación por leptina indujo la expresión de RORT en un cultivo de linfocitos T CD4+, así como incremento en la secreción de las citocinas IL-6 e IL-17 al medio de cultivo. En nuestras condiciones, este efecto fue similar al efecto de inducir la diferenciación hacia el fenotipo Th17 inducido mediante un cocktail de citocinas y anticuerpos. Esto último parece sugerir, que la leptina podría jugar un papel multifuncional tanto en la activación, sobrevida y diferenciación hacia el fenotipo Th17 de las CMN y linfocitos T CD4+ de los pacientes con AR. Por otro lado, en un estudio de comparación, que incluyó 121 pacientes con AR y 90 donadores, se observó que los niveles circulantes de leptina y resistina fueron significativamente mayores en pacientes con AR de actividad clínica alta, en comparación de aquellos con baja actividad, así como con los donadores; relación que no fue observada para la adiponectina. Por su parte, después de un análisis de correlación se observó una asociación entre los niveles de leptina con la actividad clínica y los niveles de IL-1. Mientras tanto, los niveles de resistina se correlacionaron positivamente sólo con la actividad clínica. En un aspecto muy diferente, los niveles de Acrp30 correlacionaron positivamente con los niveles de TNF-α e IL-1, pero no con la actividad clínica de los pacientes. Finalmente, observamos una clara correlación entre los niveles de IL-6 e IL-17, y de ellos con la actividad clínica. Ajusta resaltar que las asociaciones observadas fueron independientes del Índice de masa corporal o estado de obesidad de los pacientes reclutados en el estudio. Conclusiones: Las CMN y linfocitos CD4+ derivadas de sangre periférica de pacientes con AR fueron significativamente más sensibles a la incubación con las adipocitocinas leptina y Acrp30. Asimismo, la respuesta a estas adipocitocinas parece correlacionar positivamente con la actividad clínica de los pacientes. Por otro lado, la leptina podría jugar un papel relevante para favorecer el fenotipo Th17 en linfocitos T. Finalmente, en un estudio transversal pudimos confirmar que los niveles circulantes de las adipocitocinas fueron mayores en los pacientes, en comparación con los donadores y que las concentraciones se correlacionaron positivamente con X la actividad clínica de los pacientes. Todo esto parece sugerir que los altos niveles de las adipocitocinas en la sangre de los pacientes con AR juegan un papel importante para explicar la alta reactividad celular, alta respuesta inflamatoria, sobrevivencia e incluso diferenciación de linfocitos T hacia el fenotipo Th17.

ABSTRACT Rheumatoid Arthritis is an autoimmune and inflammatory disease that significantly increases the risk of dying and, if it is not treated properly, leads to disability and deterioration in the patient’s quality of life. Although this disease has been known for many years, due to its multifactorial etiology, it is very difficult to be able to specify the set of elements necessary to trigger the autoimmune process and/or its chronicity. Therefore, it is of great importance to provide new knowledge oriented to the elucidation of the mechanisms that could intervene in the development of this disease. On the other hand, in recent years, molecules derived from adipose tissue known as adipocytokines, seem to play a very important role not only in regulating the energy metabolism of the individual, but also significantly influence the control of pathological inflammatory processes. Among them, leptin, adiponectin (Acrp30) and resistin are molecules with a clear influence on immunological regulation; however, their comparative effects on blood cells and, in particular CD4 + T lymphocytes, have not been systematically characterized. Likewise, although it has been proposed that circulating levels of adipocytokines could play an effect on the development and clinical status of patients with RA, their association with pro-inflammatory cytokines and the clinical activity of Mexican patients is not known. Objectives: To characterize the in vitro effect of adipocytokines on the cellular response (proliferation, activation, induction of cytokines, differentiation and cell death) in peripheral blood mononuclear cells of healthy donors and patients with Rheumatoid Arthritis as well as to evaluate the association between levels circulating adipocytokines and the clinical activity of patients with RA. Methodology: Samples from patients with RA according to the ACR / EULAR 2010criteria who attended the Hospital General de Cuernavaca were included and0 their clinical activity (DAS28) was determined. Blood samples from donors of the CETS-Morelos were also included. The mononuclear cells (CMN) derived from peripheral blood were isolated by the Ficoll-Paque technique and the isolation of XII CD4 + T cells was performed with magnetic beads. The in vitro tests were performed with recombinant human leptin and Acrp30. Proliferative and activation effect were evaluated by the MTT technique and the expression of the markers CD25 and CD69, was performed by flow cytometry. The levels of IL-2 and TNFα in the culture supernatants, as well as the levels of adipocytokines in plasma (leptin, Acrp30 and resistin), were evaluated by ELISA. The resistance to apoptosis induced by etoposide was evaluated by YoPro / propidium iodide. The expression of STAT3 and RORᵧT was evaluated by the Western Blot technique. Analytical statistics were used, using means and standard deviation for the description. For comparisons between groups, the Mann-Whitney test was used and for the correlation analysis the Spearman test was used, considering p <0.05 as significant. Results: When evaluating the capacity, by induction through adipocytokines, a proliferative effect could be observed both in the donor cells and in patients with RA and in cells derived from the latter group of individuals a statistical correlation could be observed between the activity of the disease and the proliferation induced by leptin and Acrp30. On the other hand and interestingly, CMNs derived from patients showed a greater response when incubated with adipocytokines in vitro, either based on their activation markers (CD25, CD69, leptin receptor, pSTAT3), as well as on the secretion of proinflammatory cytokines (IL-1β, IL-2, IL-6 and TNF) compared to the MNCs of the donors. Additionally, it was observed that IL-2 secretion induced by the incubation of leptin with CMN from patients correlated significantly with clinical activity. Also, in cell death assays, it was observed that incubation with leptin or Acrp30 seem to "rescue from apoptosis" induced by treatment with etoposide. On the other hand, and in support of our proposal of the existence of a functional relationship between leptin and the Th17 phenotype, we observed in our in vitro system that incubation with leptin induced the expression of RORᵧT in a culture of CD4 + T lymphocytes, as well as an increase in the secretion of IL-6 and IL-17 to the culture medium. In our conditions, this effect was similar to the effect of inducing differentiation towards the Th17 phenotype induced by acocktail of cytokines and antibodies. The latter seems to suggest that leptin could play a multifunctional role in both the activation, survival and differentiation towards a Th17 phenotype on CMN and lymphocytes.