Hidrólisis de compuestos tiofosfatos con albúminas del suero de mamíferos

Los compuestos organofosforados (OP) se consideran de gran preocupación debido a su neurotoxicidad. Los tratamientos actuales de la intoxicación son ineficaces. Las A-esterasas son enzimas capaces de hidrolizar OP cuando se activan por cofactores de metales divalentes. Nuestro grupo de investigación se ha especializado en la búsqueda de A- esterasas en sueros de diferentes especies. Se encontró que la albúmina sérica de aves domésticas y marinas mostraba una A-esterasa dependiente de Cu²⁺. Esta actividad se detectó solo en aves, pero en 2017 nuestro grupo de investigación observó una actividad dependiente de Cu²⁺ en el suero de cabra sobre el insecticida quiral tricloronato (TCN). La A-esterasa más conocida en el suero de mamíferos (PON1) es activada por Ca²⁺ y no hidroliza TCN, lo que sugiere que una o más proteínas en el suero de mamíferos son capaces de hidrólisis de OP. Identificar y caracterizar estas enzimas es importante para los campos médico, veterinario y ambiental. En este trabajo realizamos estudios ex vivo de la hidrólisis de TCN en suero y sus albúminas de humanos y otros mamíferos domésticos (perro, cabra, cerdo, ovejas y vaca) en presencia de Cu²⁺, Ca²⁺ y EDTA mediante espectrofotometría UV-Vis y cromatografía quiral. La albúmina sérica de cabra (GSA) mostró actividad hidrolizante dependiente de Cu²⁺ sobre la mezcla racémica del insecticida TCN. Una alícuota de 200 μg/mL de GSA mostró una actividad hidrolizante superior al 75% después de 60 min de reacción con sulfato de cobre a una concentración 100 y 300 μM en condiciones fisiológicas de pH=7,4 y 37 °C. Esta actividad estuvo entre un 38% y un 58% mayor con respecto a otras albúminas de mamíferos. La actividad TCNasa de la GSA fue estereoselectiva, ya que el isómero (+)-TCN presento niveles de hidrólisis significativas (p˂0.05) de un 45% con respecto a su correspondiente enantiomero (–)-TCN que mostro niveles de un 33 %. Mientras, las actividades dependientes de Ca²⁺ (2.5 mM) y resistentes a EDTA (5 mM) (1-6%) no fueron significativas (p>0.05). Esto sugiere que la GSA es la proteína responsable de la actividad TCNasa dependiente de Cu²⁺ en el suero de cabra. Con el propósito de identificar el sitio de unión de Cu²⁺ y TCN a GSA, se realizó un estudio de cálculos de acoplamiento y dinámica molecular, e residuo de His145 de la GSA podría estar involucrado en el sitio activo de la actividad A-esterasa de esta proteína.

Organophosphate (OP) compounds are considered a high concern due to their neurotoxicity. Current treatments of intoxication are inefficient. A-esterases are enzymes capable of hydrolyzing OP when activated by divalent metal cofactors. Our research group has specialized in the A-esterases search in sera of different species. The domestic and seabirds’ serum albumin was found to show a Cu²⁺ -dependent A-esterase. This activity was detected only in birds but in 2017 our research group observed a Cu²⁺ -dependent activity in goat serum on the chiral insecticide trichloronate (TCN). The best-known A-esterase in mammalian serum (PON1) is activated by Ca²⁺ and does not hydrolyze TCN which suggests that one or more proteins in mammalian serum are capable of OP hydrolysis. Identifying and characterizing these enzymes is important for medical, veterinary, and environmental fields. In this work we did ex vivo studies of the TCN hydrolysis in serum and its albumins from humans and other domestic mammals (dogs, goats, pigs, sheep and bovine) in presence of Cu²⁺, Ca²⁺ and EDTA using UV-Vis spectrophotometry and chiral chromatography for measuring the compound hydrolysis. Goat serum albumin (GSA) showed Cu²⁺ -dependent hydrolyzing activity on the insecticide TCN. 200 μg/mL of GSA reaches a substrate conversion greater than 75% after 60 min of reaction with 100 and 300 μM copper sulfate under physiological conditions of pH=7.4 and 37 °C. This activity was 38-58% higher than those observed in our laboratory for other mammals. At the tested conditions, GSA was significantly (p < 0.05) stereoselective (+)-TCN ˃ (–)-TCN (45% vs. 33%). Ca²⁺ -dependent (2.5mM) and EDTA-resistant activities (5mM) (1-6%) were not significant (p>0.05). This suggests that GSA is the protein responsible for theCu²⁺ -dependent TCNase activity in goat serum. To study Cu²⁺ and TCN binding to GSA, we performed a molecular docking and dynamic calculations, His145 could be involved in the active site of the protein.