Bases moleculares de los flujos de Ca²⁺ en el acrosoma del espermatozoide de ratón

El acrosoma es un reservorio ácido de Ca²⁺ localizado en el extremo apical de la cabeza del espermatozoide. En los mamíferos, uno de los pasos claves que asegura una exitosa fecundación es la reacción acrosomal (RA). La RA consiste en una cascada de eventos moleculares dependientes de Ca²⁺ que resulta en la liberación del contenido acrosomal mediante su exocitosis y la exposición de una nueva membra plasmática con capacidad fusogénica. Se ha propuesto que el canal de Ca²⁺ específico del espermatozoide (CatSper) es una de las principales vías de ingreso de Ca⁺ que regula la RA. Recientes hallazgos muestran que los inhibidores de CatSper, Mibefradil y NNC 55-0396 son bases débiles anfipáticas capaces de incrementar el pHacrosomalᵃᶜʳᵒˢᵒᵐᵃˡ (pHₐ) en el espermatozoide de humano y ratón. La alcalinización del acrosoma estimula la liberación del Ca²⁺ almacenado en el organelo e induce un incremento en la concentración de Ca²⁺ intracelular ([Ca²⁺]ᵢ) desencadenando la RA. No obstante, se desconoce el mecanismo de transporte de Ca²⁺ asociado al incremento de pHₐ en el espermatozoide de mamífero. Con base en lo anterior, el objetivo de este trabajo fue investigar las vías asociadas con el aumento de Ca²⁺ intracelular durante la alcalinización del acrosoma teniendo como modelo de estudio el espermatozoide de ratón. Usando microscopia de epifluorescencia en célula única e inhibidores de CatSper, monitoreamos los cambios en la [Ca²⁺]ᵢ asociados con el incremento de pHa en la cabeza del espermatozoide. Encontramos que la alcalinización del acrosoma origina la liberación del Ca²⁺ almacenado sin comprometer la integridad del organelo. Conjuntamente, usamos el agente lisosomotrópico, Gly-Phe-β-naftilamida para evaluar la contribución del estrés osmótico en las señales de Ca²⁺ dependientes del incremento de pHₐ. Nuestros resultados indican que el componente osmótico no contribuye significativamente en la liberación de Ca²⁺ acrosomal durante la alcalinización del organelo. Para establecer el mecanismo molecular que subyace en las señales de Ca²⁺ asociadas con el aumento de pHₐ, usamos antagonistas de los canales permeables a Ca²⁺ expresados en el acrosoma y la membrana plasmática del espermatozoide de ratón. El tratamiento con el Ned 19, un antagonista de los canales de dos poros 1 (expresados en el acrosoma) redujo significativamente la liberación de Ca²⁺ acrosomal dependiente del incremento de pHₐ . Asimismo, el tratamiento con los antagonistas (2-APB y SKF-96365) de los canales de Ca²⁺ activados por la liberación de Ca²⁺ (expresados en la membrana plasmática) redujo significativamente la entrada de Ca²⁺ extracelular estimulada por la liberación de Ca²⁺acrosomal asociada con la alcalinización del organelo. Nuestros hallazgos revelan un papel novedoso del pHₐ en el control del eflujo de Ca²⁺ acrosomal y la entrada de Ca²⁺ extracelular durante la RA en el espermatozoide de ratón.

The acrosome is a lysosome-related vesicular organelle located in the sperm head. The acrosomal reaction (AR) is an exocytic process mediated by Ca²⁺ and essential for mammalian fertilization. It has been proposed that the flagellar-specific Ca²⁺ channel (CatSper) contributes to Ca²⁺entry triggering the AR. Recent findings show that CatSper inhibitors, Mibefradil (Mib), and NNC 55-0396 (NNC) are amphipathic weak bases able to alkalinize the acrosome in human and mouse sperm. Acrosomal pH (pHₐ) elevation induces Ca²⁺ release from the organelle and stimulates the increase of intracellular Ca²⁺ concentration ([Ca²⁺]ᵢ) triggering AR. However, the mechanisms of Ca²⁺ transport remain unknown in mammalian sperm. Here, we investigated the pathways associated with the pHa increase-induced Ca²⁺ signals using mouse sperm as a model. Using single-cell epifluorescence microscopy, we monitored [Ca²⁺]ᵢ changes associated with pHₐ increase caused by CatSper inhibitors in the sperm head. Our findings show that Mib and NNC increase pHₐ and release acrosomal Cₐ²⁺ without compromising acrosomal membrane integrity. We also used the lysosomotropic agent, Gly-Phe-β-naphthylamide to evaluate the contribution of osmotic stress in Ca²⁺ signals during acrosomal alkalinization. Our results show that the osmotic component does not significantly contribute to acrosomal Ca²⁺ release caused by pHa elevation. To establish the molecular mechanism underlying Ca²⁺ signals associated with pHa increase, we used different antagonists of Ca²⁺ channels localized in the acrosome and the plasma membrane of mouse sperm. The treatment with Ned 19, an antagonist of two-pore channel 1 (expressed in the acrosome) significantly reduced the acrosomal Ca²⁺ release dependent on pHₐ increase. Likewise, the treatment with antagonists (2-APB and SKF-96365) of Ca²⁺ channels activated by Ca²⁺ release (expressed on the plasma membrane) significantly reduced extracellular Ca²⁺ influx stimulated by acrosomal Ca²⁺ release associated with organelle alkalinization. Finally, our findings contribute to understanding how pHa controls acrosomal Ca²⁺ efflux and extracellular Ca²⁺ entry during AR in mouse sperm.