Producción de compuestos antiinflamatorios en cultivos transformados de Sphaerlacea angustifolia

Sphaeralcea angustifolia es una planta utilizada tradicionalmente para el tratamiento de procesos inflamatorios y problemas gastrointestinales. El extracto diclorometano de tejidos aéreos de esta especie resulto ser activo como antiinflamatorio e inmunomodulador en modelos de inflamación aguda (acetato de tetradecanoilforbol, TPA) y crónica (adjuvate completo de Freund, ACF) en ratón. La cumarina conocida como escopoletina aislado del extracto se ha reportado como antiinflamatorio, inmunomodulador, inhibidor angiogénico y revertir las alteraciones histopatológicas en el modelo de artritis en ratas inducida por ACF. El cultivo de células en suspensión de S. angustifolia ha sido explorado como sistema de producción de escopoletina; en donde también se indujo la síntesis de tomentina y ácido sphaerálcico. Los extractos diclorometano-metanol de biomasas celulares, tomentina y ácido sphaerálcico presentaron actividad antiinflamatoria e inmunomoduladora en modelos de inflamación (TPA y λ-carragenina) y artritis inducida por caolín/λ-carragenina (C/C) en ratones. La producción de escopoletina y ácido sphaerálcico se optimizó en las suspensiones celulares por restricción de nitratos en el medio de cultivo de Murashigue y Skoog (MS) y el bio-proceso celular se escaló a biorreactor de agitación mecánica de 2L. Con base a la estabilidad bioquímica y genética de los cultivos de raíces transformadas con Agrobacterium rhizogenes, se propuso la obtención de raíces pilosas de S. angustifolia como un sistema biotecnológico productor de compuestos activos. Se evaluaron 2 cepas A. rhizogenes de tipo agropina (ATCC 15834/pTDT y A4/pTDT) y una de tipo cucumopina (K599/pTDT). La mayor frecuencia de transformación mediada por A. rhizogenes ATCC 15834/pTDT se obtuvo con segmentos nodales (59.5 ± 10.5 %) y hojas (40.0 ± 25 %) de plántulas de 2 meses de edad. Se seleccionaron 6 líneas de raíces pilosas provenientes de nodo (SaTR N) y 1 de hoja (SaTR H) con base a sus características fenotípicas e índice de crecimiento; así como una línea de callo proveniente de hoja. La transformación genética de las raíces pilosas y callo se confirmó amplificando un fragmento de 490 pb del gen rolC. El índice de crecimiento entre las 7 líneas de raíces pilosas en medio líquido fue diferente, siendo la línea SaTR N 5.1 la línea con mayor crecimiento. La línea SaTR N7.2 presentó la mayor producción de ácido sphaerálcico (17.6 ± 1.72 mg/g PS), cuyo rendimiento fue superior a los reportados en planta silvestre (440 veces), en suspensiones celulares cultivadas en medio MS con restricción de nitrato en matraces (263 veces) y en biorreactor tipo tanque agitado (5 veces); sin embargo, esta línea de raíz pilosa presentó el VII índice de crecimiento más bajo, posiblemente debido a que la sobreproducción afectó negativamente su crecimiento por un efecto tóxico. Las líneas SaTR N7.2, SaTR N5.1, SaTR N7.1 y SaTR N15.1 excretaron ácido sphaerálcico en el medio de cultivo a niveles similares. Después de 2 años en cultivo, las raíces pilosas de S. angustifolia provenientes de nodo siguen produciendo escopoletina y ácido sphaerálcico. La línea de raíces pilosas SaTR H2.2 proveniente de hoja no produjo los compuestos activos. El callo desarrollado en un explante de hoja de S. angustifolia en el sitio de infección con A. rhizogenes mostró crecimiento constante en medio MS sin reguladores de crecimiento vegetal; con este tejido de callo se estableció el cultivo de células en suspensión (línea SaH3.1) en medio MS libre de reguladores de crecimiento. En paralelo, células transformadas en suspensión (SaH3.1) y células no transformadas en suspensión de callo generado de hojas de S. angustifolia se cultivaron en medio MS con 1mg/L ácido naftalenácetico (ANA) y 0.1 mg/L de Kinetina (Kin). El índice de crecimiento de los cultivos de células transformadas en suspensión (SaH3.1) libre de hormonas y con la adición de ANA y Kin fue superior a los obtenidos en el cultivo de células en suspensión no transformadas. Ácido sphaerálcico se detectó únicamente en los cultivos celulares transformados (SaH3.1), y con la adición de ANA al medio MS se duplicó la producción de ácido sphaerálcico (0.39 ± 0.11). Con base a estos resultados se evaluó el efcto de la adición de ANA (1, 2 y 4 mg/L) sobre el crecimiento y producción de activos en la suspensión celular SaH3.1. En la primera semana de cultivo, la mayor acumulación y excreción de ácido sphaerálcico se obtuvo con la concentración de 4 mg/L de ANA. La acumulación y excreción de ácido sphaerálcico y escopoletina se redujo en las semanas 2 y 3 del cultivo. Con base a la similitud estructural de ANA y el ácido 1,4- dihidroxinaftoico, derivado naftoico obtenido a partir de p-hidroxibenzoico, se postuló que ANA podría actuar como precursor en la biosíntesis del ácido sphaerálcico.

Abstract Sphaeralcea angustifolia is a plant traditionally used for the treatment of inflammatory processes and gastrointestinal problems. The dichloromethane extract from aerial tissues of this species was active as anti-inflammatory and immunomodulator in mouse models of acute (tetradecanoylphorbol acetate, TPA) and chronic (Freund's complete adjuvant, FCA) inflammation. The scopoletin, the active compound isolated from the extract, has been reported as anti-inflammatory, immunomodulatory, angiogenic inhibitory and reversal of histopathological alterations in the ACF-induced arthritis model in rats. Cell in uspension culture of S. angustifolia was explored as a production system for scopoletin; besides, the tomentin and sphaeralcic acid synthesis was induced. Dichloromethane-methanol extracts of cell biomass, tomentin and sphaeralcic acid demonstrated anti-inflammatory and immunomodulatory activity in models of inflammation (TPA and λ-carrageenan) and arthritis induced by kaolin/λ-carrageenan (C/C) in mice. The production of scopoletin and sphaeralcic acid was optimized in the cells in suspensions by reduction of nitrate concentration in the Murashigue and Skoog (MS) culture medium and the cell bioprocess was scaled up to a mechanical agitation bioreactor of 2.0 L. Based on the biochemical and genetic stability of transformed root with Agrobacterium rhizogenes, obtaining hairy roots of S. angustifolia was proposed as a biotechnological system to produce active compounds. Two A. rhizogenes strains of agropine type (ATCC 15834/pTDT and A4/pTDT) and one of cucumopine type (K599/pTDT) were evaluated. The highest frequency of transformation mediated by A. rhizogenes ATCC 15834/pTDT was obtained with nodal segments (59.5 ± 10.5 %) and leaves (40.0 ± 25 %) of 2-month-old seedlings. Six hairy root lines from node (SaTR N) and one from leaf (SaTR H) were selected based on their phenotypic characteristics and growth index; as well as a line of callus from leaf. Genetic transformation of hairy roots and callus was confirmed by amplifying a 490 bp fragment of the rolC gene. The growth index among the 7 hairy root lines in liquid medium was different, being the SaTR N 5.1 line with highest growth. The SaTR N7.2 line presented highest production of sphaeralcic acid (17.6 ± 1.72 mg/g PS), whose yield was higher than those reported in the wild plant (440 times), in cell suspensions cultured in MS medium with nitrate restriction in flasks (263 times) and stirred tank type bioreactor (5 times); however, this hairy root line had the lowest growth index, possibly because overproduction negatively affected its growth due to a toxic effect. The SaTR N7.2, SaTR N5.1, SaTR N7.1 and SaTR N15.1 lines excreted sphaeralcic acid in the culture medium at similar levels. After 2 years in culture, hairy X roots of S. angustifolia from the node continue to produce scopoletin and sphaeralcic acid. The line of hairy roots from the leaf (SaTR H2.2) did not produce the active compounds. Callus developed on the site of infection of S. angustifolia leaf explant with A. rhizogenes showed constant growth in MS medium without plant growth regulators; with this callus tissue, cells in suspension (SaH3.1 line) was established in MS medium free of growth regulators. In parallel, transformed cells in suspension (SaH3.1) and non-transformed cells in suspension from leaf callus of S. angustifolia were cultivated in MS medium with 1mg/L naphthaleneacetic acid (NAA) and 0.1 mg/L Kinetin (Kin). The growth index of transformed cell suspension (SaH3.1) cultures free of hormones and with the addition of NAA and Kin was higher than that obtained in the non- transformed cell in suspension culture. Sphaeralcic acid was detected only in the transformed cell (SaH3.1) cultures and with the addition of NAA the production of sphaeralcic acid was doubled (0.39±0.11). Based on these results, the effect of NAA adding (1, 2 and 4 mg/L) on the growth and production of active compounds in the SaH3.1 cell in suspension was evaluated. In the first week of culture, the highest accumulation and excretion of sphaeralcic acid was obtained with a concentration of 4 mg/L of NAA. Accumulation and excretion of sphaeralcic acid and scopoletin were reduced after 2 and 3 weeks of culture. Based on the structural similarity of NAA and 1,4- dihydroxynaphthoic acid, a naphthoic derivative obtained from p-hydroxybenzoic acid, it was postulated that NAA could act as a precursor in the biosynthesis of sphaeralcic acid.