Desarrollo y validación de un método bioanalítico para la cuantificación de metotrexato en lisado de eritrocitos

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad crónica, inflamatoria y autoinmune; que sin un tratamiento adecuado puede derivar en discapacidad y disminución de la esperanza de vida del paciente. El metrotexato (MTX), a dosis <25mg/semana, es el principal medicamento en el tratamiento del paciente con AR, debido a su efectividad, el control de efectos adversos (tras su coadministración con ácido fólico) y su bajo costo. Aunque su mecanismo de acción no es del todo comprendido; se considera que sus metabolitos (especies poliglutaminadas de MTX) son los responsables de su acción antiinflamatoria e inmunosupresora y se ha observado que su acumulación en eritrocitos es diferente entre aquellos pacientes que responden a MTX y aquellos que no lo hacen. Estas observaciones han llevado a considerar que la medición de los niveles de MTX y sus metabolitos en eritrocitos permitiría, eventualmente, proporcionar un método para monitorear la respuesta terapéutica. Sin embargo, hasta ahora los métodos desarrollados para monitorear las concentraciones de MTX y sus metabolitos en eritrocitos son sumamente costosos, lo que ha comprometido su aplicación en el ámbito clínico. Desafortunadamente no se pudo contar con estándar de las formas poliglutaminadas del MTX, por lo cual se propuso como objetivo de este proyecto el desarrollar y validar una metodología bioanalítica para la cuantificación sólo del MTX en eritrocitos de pacientes con AR. En ese sentido, se desarrolló un sistema para la detección de MTX por CLAR-UV empleando como fase móvil citrofosfato pH 6: acetonitrilo, en proporción 95:5 y como fase estacionaria una columna C18 con carga de carbono al 18% y un detector UV-longitud de onda variable a λ=302 nm. Para la extracción de MTX se propuso una extracción líquido-líquido por el método de precipitación de proteínas metanol-cloroformo-agua. El estudio de validación indicó que la cuantificación de MTX en lisado de eritrocitos no presenta interferencias endógenas para MTX. Así mismo, el método generado permite la identificación y diferenciación inequívoca de MTX y ácido fólico. Se detectó una correlación lineal entre la concentración y el área de MTX, lo que permite el empleo de un modelo de ajuste lineal en un rango de concentración de 25 a 225 ng/ml. Dado que los criterios de aceptación para exactitud se cumplen a concentraciones >50 ng/ml y para precisión a concentraciones >125 ng/ml; el límite de cuantificación se estableció en 125 ng/ml. De manera teórica, se calculó un límite de detección en 4.61 ng/ml. Respecto al recobro, éste fue superior al 65% y se comprobó una estabilidad a concentración de 200 ng/ml durante almacenamiento a -20°C por 30 días. El análisis de muestras de sangre de pacientes detectó MTX en siete de diez muestras analizadas; sin embargo, los niveles de MTX observados estuvieron entre 14.41 ng/ml y 87.17 ng/ml y, por lo tanto, por debajo del límite de cuantificación de la metodología desarrollada.

Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic and inflammatory and autoimmune disease; without a treatment can derived to disability and a decrease in the patient's life expectancy. Methotrexate (MTX), at doses <25mg/week, is the main drug use for the treatment of patients with RA, due to its effectiveness, adverse effects control (after co-administration with folic acid) and its low cost. Although its mechanism of action is not fully understood, its metabolites (methotrexate polyglutamates) are considered to be responsible for its anti-inflammatory and immunosuppressive action and its accumulation in erythrocytes has been observed to be different between those patients who respond to MTX and those who do not. These observations have led us to consider that the measurement of the levels of MTX and its metabolites in erythrocytes would eventually provide a method to monitor the therapeutic response. However, until today the methods developed to monitor concentrations of MTX and metabolites in erythrocytes are extremely expensive, which has compromised their application in the clinical practice. Unfortunately, it was not possible to have a standard for the polyglutaminated forms of MTX, which is why it was proposed as the objective of this project to develop and validate a bioanalytical methodology for the quantification only of MTX in erythrocytes of patients with RA. For it we to develop a system for the detection of MTX by UV-HPLC using 95:5 citrophosphate pH 6: acetonitrile, as mobile phase and, as stationary phase, a C18 column with 18% carbon load and a UV detector-variable wavelength at λ=302 nm. For the extraction of MTX, a liquid-liquid extraction was proposed by the methanol-chloroform-water protein precipitation method. The validation study indicated that the quantification of MTX in erythrocyte lysate does not present endogenous interferences for MTX. Likewise, the generated method allows the identification and unequivocal differentiation of MTX and folic acid. A linear correlation was detected between the concentration and the area of MTX, which allows the use of a linear fit model in a concentration range of 25 to 225 ng/ml. Given that the acceptance criteria for accuracy are met at concentrations >50 ng/ml and for precision at concentrations >125 ng/ml; the limit of quantification was established at 125 ng/ml. Theoretically, a detection limit of 4.61 ng/ml was calculated. Regarding recovery, it was higher than 65% and stability at a concentration of 200 ng/ml was verified during storage at -20° C for 30 days. Sample analysis detected MTX in seven of ten blood samples of RA patient tested; however, the MTX levels observed (14.41 ng/ml to 87.17 ng/ml) were below the limit of quantification of the developed methodology.