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Producción de compuestos antiinflamatorios en cultivos transformados de Sphaeralcea angustifolia

dc.rights.licensehttp://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0 - Atribución-NoComerciales_MX
dc.contributorJOSE DE JESUS ARELLANO GARCIAes_MX
dc.contributor.authorROGELIO REYES PEREZes_MX
dc.contributor.otherdirector - Directores_MX
dc.coverage.spatialMEX - Méxicoes_MX
dc.date2022-06-15
dc.date.accessioned2022-06-27T14:48:57Z
dc.date.available2022-06-27T14:48:57Z
dc.identifier.urihttp://riaa.uaem.mx/handle/20.500.12055/2476
dc.descriptionResumen Sphaeralcea angustifolia es una planta utilizada tradicionalmente para el tratamiento de procesos inflamatorios y problemas gastrointestinales. El extracto diclorometano de tejidos aéreos de esta especie resulto ser activo como antiinflamatorio e inmunomodulador en modelos de inflamación aguda (acetato de tetradecanoilforbol, TPA) y crónica (adjuvate completo de Freund, ACF) en ratón. La cumarina conocida como escopoletina aislado del extracto se ha reportado como antiinflamatorio, inmunomodulador, inhibidor angiogénico y revertir las alteraciones histopatológicas en el modelo de artritis en ratas inducida por ACF. El cultivo de células en suspensión de S. angustifolia ha sido explorado como sistema de producción de escopoletina; en donde también se indujo la síntesis de tomentina y ácido sphaerálcico. Los extractos diclorometano-metanol de biomasas celulares, tomentina y ácido sphaerálcico presentaron actividad antiinflamatoria e inmunomoduladora en modelos de inflamación (TPA y λ-carragenina) y artritis inducida por caolín/λ-carragenina (C/C) en ratones. La producción de escopoletina y ácido sphaerálcico se optimizó en las suspensiones celulares por restricción de nitratos en el medio de 186 cultivo de Murashigue y Skoog (MS) y el bio-proceso celular se escaló a biorreactor de agitación mecánica de 2L. Con base a la estabilidad bioquímica y genética de los cultivos de raíces transformadas con Agrobacterium rhizogenes, se propuso la obtención de raíces pilosas de S. angustifolia como un sistema biotecnológico productor de compuestos activos. Se evaluaron 2 cepas A. rhizogenes de tipo agropina (ATCC 15834/pTDT y A4/pTDT) y una de tipo cucumopina (K599/pTDT). La mayor frecuencia de transformación mediada por A. rhizogenes ATCC 15834/pTDT se obtuvo con segmentos nodales (59.5 ± 10.5 %) y hojas (40.0 ± 25 %) de plántulas de 2 meses de edad. Se seleccionaron 6 líneas de raíces pilosas provenientes de nodo (SaTR N) y 1 de hoja (SaTR H) con base a sus características fenotípicas e índice de crecimiento; así como una línea de callo proveniente de hoja. La transformación genética de las raíces pilosas y callo se confirmó amplificando un fragmento de 490 pb del gen rolC. El índice de crecimiento entre las 7 líneas de raíces pilosas en medio líquido fue diferente, siendo la línea SaTR N 5.1 la línea con mayor crecimiento. La línea SaTR N7.2 presentó la mayor producción de ácido sphaerálcico (17.6 ± 1.72 mg/g PS), cuyo rendimiento fue superior a los reportados en planta silvestre (440 veces), en suspensiones celulares cultivadas en medio MS con restricción de nitrato en matraces (263 veces) y en biorreactor tipo tanque agitado (5 veces); sin embargo, esta línea de raíz pilosa presentó el índice de crecimiento más bajo, posiblemente debido a que la sobreproducción afectó negativamente su crecimiento por un efecto tóxico. Las líneas SaTR N7.2, SaTR N5.1, SaTR N7.1 y SaTR N15.1 excretaron ácido sphaerálcico en el medio de cultivo a niveles similares. Después de 2 años en cultivo, las raíces pilosas de S. angustifolia provenientes de nodo siguen produciendo escopoletina y ácido sphaerálcico. La línea de raíces pilosas SaTR H2.2 proveniente de hoja no produjo los compuestos activos. El callo desarrollado en un explante de hoja de S. angustifolia en el sitio de infección con A. rhizogenes mostró crecimiento constante en medio MS sin reguladores de crecimiento vegetal; con este tejido de callo se estableció el cultivo de células en suspensión (línea SaH3.1) en medio MS libre de reguladores de crecimiento. En paralelo, células transformadas en suspensión (SaH3.1) y células no transformadas en suspensión de callo generado de hojas de S. angustifolia se cultivaron en medio MS con 1mg/L ácido naftalenácetico (ANA) y 0.1 mg/L de Kinetina (Kin). El índice de crecimiento de los cultivos de células transformadas en suspensión (SaH3.1) libre de hormonas y con la adición de ANA y Kin fue superior a los obtenidos en el cultivo de células en suspensión no transformadas. Ácido sphaerálcico se detectó únicamente en los cultivos celulares transformados (SaH3.1), y con la adición de ANA al medio MS se duplicó la producción de ácido sphaerálcico (0.39 ± 0.11). Con base a estos resultados se evaluó el efcto de la adición de ANA (1, 2 y 4 mg/L) sobre el crecimiento y producción de activos en la suspensión celular SaH3.1. En la primera semana de cultivo, la mayor acumulación y excreción de ácido sphaerálcico se obtuvo con la concentración de 4 mg/L de ANA. La acumulación y excreción de ácido sphaerálcico y escopoletina se redujo en las semanas 2 y 3 del cultivo. Con base a la similitud estructural de ANA y el ácido 1,4- dihidroxinaftoico, derivado naftoico obtenido a partir de p-hidroxibenzoico, se postuló que ANA podría actuar como precursor en la biosíntesis del ácido sphaerálcico. En el análisis por HPLC del extracto diclorometano: metanol de células en suspensión transformadas se observó la presencia de 2 compuestos mayoritarios que no han sido reportados en planta silvestre, un compuesto (1) con tiempo de retención de 7.84 min y absorción máxima de λ=341 y 213.4 nm; el segundo compuesto (2) con tiempo de retención de 10.39 min y máxima absorción a λ=377.8 y 214.5 nm. Del fraccionamiento en columna abierta del extracto CH2Cl2:CH3OH de las células en suspensión transformadas con el sistema de gradientes de H2O:CH3CN, se aislaron los compuestos 1 y 2 en las reuniones 3 (90:10) y 9 (70:30), respectivamente. Los espectros de RMN de 1H y 13C de los compuestos 1 y 2 nos determina que corresponde a derivados de fraxetina denominado 8-O-ramnósido de fraxetina (1) y 8-O-glucopiranósido de 3,6,7-trimetoxicumarina (2). El extracto CH2Cl2:CH3OH (100 mg/kg) mostró un efecto gastroprotector (82.01 ± 3.42%) similar al del control positivo omeprazol (86.66 ± 12.36; 20 mg/kg) en el modelo de úlceras gástricas inducidas con etanol en ratón. El efecto gastroprotector puede ser atribuído a las cumarinas presentes en el extracto como la escopoletina y los compuestos aislados 1 y 2. Las cumarinas son reportadas como antiinflamatorios, por ejemplo, la cumarina y su derivado 7-hidroxi inhiben la biosíntesis de prostaglandinas; además, se ha demostrado que esculetina, fraxetina, dafnetina, escopoletina y otros derivados de cumarinas son reconocidos como inhibidores enzimáticos de la lipoxigenasa y la ciclooxigenasa, así como de la bomba de protones H+/K+-ATPasa.es_MX
dc.formatpdf - Adobe PDFes_MX
dc.languagespa - Españoles_MX
dc.publisherEl autores_MX
dc.rightsopenAccess - Acceso Abiertoes_MX
dc.subject2 - BIOLOGÍA Y QUÍMICAes_MX
dc.subject.other24 - CIENCIAS DE LA VIDAes_MX
dc.titleProducción de compuestos antiinflamatorios en cultivos transformados de Sphaeralcea angustifoliaes_MX
dc.typedoctoralThesis - Tesis de doctoradoes_MX
uaem.unidadFacultad de Ciencias Biológicas - Facultad de Ciencias Biológicases_MX
uaem.programaDoctorado en Ciencias Naturales - Doctorado en Ciencias Naturaleses_MX
dc.type.publicationacceptedVersiones_MX
dc.audienceresearchers - Investigadoreses_MX
dc.date.received2022-06-24


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  • Colección Tesis Posgrado [1896]
    Se trata de tesis realizadas por estudiantes egresados de programas de posgrado de nuestra institución.

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