Estudio de lacasas desplegadas en superficie de saccharomyces cerevisiae en la oxidación de compuestos fenólicos presentes en hidrolizados lignocelulósicos

RESUMEN Uno de los mayores retos de la actualidad es el desarrollo y producción de energías renovables y sustentables, que presenten bajo impacto ambiental y que logren contender con la alta demanda energética. Este interés se ha ido intensificando debido al uso excesivo de los combustibles fósiles, así como al incremento en los gases de efecto invernadero (GEI). En los últimos años, se han adoptado estrategias que permitan sustituir a los combustibles fósiles, en las que se incluyen la energía solar, la eólica y el uso de biocombustibles. El bioproceso consolidado es una de las estrategias con mayor potencial en la producción de bioetanol y su desarrollo puede ser abordado utilizando diferentes enfoques. En este trabajo se propone el uso de la tecnología de despliegue en superficie de proteínas para integrar etapas del proceso de bioetanol, lo que permitiría acercarse al bioproceso consolidado. La integración de las etapas de detoxificación y fermentación se puede lograr empleando un sistema levadura/lacasa. La lacasa lleva a cabo la oxidación de los compuestos fenólicos presentes en los hidrolizados lignocelulósicos, reduciendo su toxicidad lo que favorece el crecimiento de la levadura y la conversión de azúcares a etanol. No obstante, al desarrollar esta idea surgieron diferentes preguntas sobre los factores que podrían afectar el proceso final. Cada una de estas preguntas fueron planteadas a lo largo de los capítulos en los que se dividió esta tesis, los cuales son descritos a continuación: Capítulo I En este capítulo se seleccionó y caracterizó el material lignocelulósico. De los diferentes materiales disponibles, la cascarilla de arroz es uno de los materiales más interesantes, por su abundancia, por ser un residuo agrícola sin valor en el mercado de la alimentación humana y por ser un cultivo importante en el estado de Morelos. La composición química de este material fue determinada, encontrando 28% de carbohidratos, 12% de lignina y 22% de cenizas. Este tipo de materiales deben ser pretratados para liberar el mayor porcentaje de azúcares, por lo que se decidió utilizar el método de ácido diluido. Las condiciones a las cuales se realiza el pretratamiento favorece la generación de compuestos inhibidores, como derivados de furano, ácidos alifáticos y compuestos fenólicos. Ya que el interés principal Resumen xiii era la remoción de los compuestos fenólicos, se determinó que factores favorecen la liberación de dichos compuestos y algunos fueron identificados y cuantificados en el hidrolizado, por ejemplo, el ácido ferúlico, ácido vanílico y ácido p-cumárico. Capítulo II Al conocer qué compuestos estaban presentes en el hidrolizado, se continuó por evaluar el efecto sobre el crecimiento de levadura del hidrolizado lignocelulósico, observando un incremento en la fase lag, así como una disminución en el rendimiento de bioetanol comparado con el cultivo sin hidrolizado. El efecto negativo sobre el crecimiento y producción de etanol del cultivo en presencia del hidrolizado fue evidente, no obstante, debido a la complejidad del hidrolizado no fue posible determinar cuál era el compuesto más tóxico o si todos afectaban de igual manera. Así que, en este capítulo se decidió evaluar individualmente el efecto de los compuestos fenólicos y determinar su efecto inhibidor sobre la levadura. Para ello fueron utilizadas 2 cepas de S. cerevisiae, una levadura comercial para la producción de cerveza y la levadura utilizada para el despliegue en superficie. Se observó que el ácido ferúlico afectaba negativamente ambas cepas, y fue el compuesto con mayor efecto inhibidor de los 8 compuestos probados. Además, se evaluó el efecto biológico de los compuestos fenólicos sobre modelos de membrana. Encontrando un efecto diferencial sobre los liposomas dependiente del compuesto probado, esto para probar si los compuestos fenólicos afectan la membrana celular de la levadura. Una vez determinado el efecto sobre la célula, se decidió realizar el tratamiento de los compuestos fenólicos y determinar si los compuestos al ser oxidados reducían o incrementaban su efecto negativo sobre la levadura. Se evaluó la capacidad oxidativa de 2 lacasas comerciales sobre compuestos fenólicos, observando que el tratamiento con lacasas del ácido ferúlico y la vainillina favorecía el crecimiento y la producción de etanol. Mientras que, el tratamiento enzimático de compuestos como el ácido siríngico y el ácido p-cumárico mostraban un mayor efecto inhibidor al ser tratados con lacasas. Por lo que se llegó a la conclusión que la detoxificación con lacasas es apropiada para hidrolizados en los que se encuentren como compuestos mayoritarios el ácido ferúlico o la vainillina. Resumen xiv Capítulo III Los resultados obtenidos con las enzimas comerciales demostraron la capacidad de las lacasas de oxidar compuestos fenólicos de diferente naturaleza. El siguiente paso fue evaluar la lacasa desplegada en superficie de S. cerevisiae en el tratamiento del hidrolizado de cascarilla de arroz, los porcentajes de oxidación obtenidos fueron entre 1.7-7%. Para solucionar la baja oxidación, se decidió probar otras lacasas desplegadas en superficie, así como incrementar la expresión de las mismas. La evolución dirigida de péptidos señal ha permitido incrementar la expresión de diferentes proteínas de interés, tomando en cuenta este enfoque se decidió realizar mutaciones sobre el gen Aga2, el cual funciona como péptido señal y ancla en el sistema de despliegue en superficie. Las variantes obtenidas del ancla Aga2 incrementaron hasta 8 veces la producción de lacasas desplegadas comparadas con el ancla silvestre. Estas variantes fueron probadas en la oxidación de compuestos fenólicos individuales mostrando porcentajes de oxidación entre 20 y 60%. Hasta el momento no existían reportes en los que se hubieran realizado mutaciones en el ancla del sistema de despliegue. Con este trabajo se logró mostrar la flexibilidad del ancla para ser evolucionada y de esta manera mejorar la expresión de proteínas, sin perder su capacidad de anclaje. Además, se respondieron ciertas interrogantes y se solucionaron inconvenientes del sistema de despliegue que ahora permitirían continuar con el siguiente paso que es evaluar el sistema lacasa/levadura en condiciones reales del hidrolizado.

SUMMARY Nowadays, the development and production of renewable and sustainable energies are the main challenges in the energy field. These energies have to present low environmental impact and should be enough to the high energy demand. This interest has been intensifying due to the overuse of fossil fuels and the increase of greenhouse gases. In recent years, strategies have been adopted to replace fossil fuels, including solar energy, wind energy and the use of biofuels. Consolidated bioprocessing is one of the strategies with high potential for bioethanol production and its development can be approached using different technologies. This work proposed the use of protein surface display technology to integrate stages of the bioethanol process, which would allow us to approach consolidated bioprocessing. Integration of the detoxification and fermentation steps can be accomplished using a yeast/laccase system. Laccase carries out the oxidation of phenolic compounds present in lignocellulosic hydrolysates, reducing their toxicity, which promotes yeast growth and the conversion of sugars to ethanol. However, in developing this idea, different questions appeared related to the factors that could affect the final process. Each question was posed throughout the chapters of this thesis, which are described below: Chapter I In this chapter, the lignocellulosic material was selected and characterized. Rice husk was selected based on its abundancy, to be an agricultural residue without human feeding value and to be an important crop in Morelos state. The chemical composition of this material was determined, founding 28% carbohydrates, 12% lignin and 22% ashes. This kind of material has to be pretreated to release the high carbohydrate content possible. It was decided to use acid-diluted pretreatment. Operational conditions used in the pretreatment step promote the generation of inhibitory compounds, such as furans derivatives, aliphatic acids and phenolic compounds. Since the main interest was the removal of phenolic compounds, it was determined which factors release these compounds and some of them were identified and quantified in the hydrolysate, for example, ferulic acid, vanillic acid and p-coumaric acid. Summary xvi Chapter II Once the phenolic compounds were identified in hydrolysate, the effect of these compounds on yeast growth was evaluated. An increase in lag phase and reduction of ethanol yield was observed in cultures with the addition of hydrolysate compared to control cultures. The negative effect on yeast growth and ethanol production of hydrolysate compounds was evident. However, is not possible to determine which compound shows the greatest toxicity or if all the compounds affect in the same way, mainly due to the complexity of hydrolysate. Thus, in this chapter, the biological effect of phenolic compounds was evaluated individually. Two yeast strains were used, one of them a beer commercial strain and the other the strain used for yeast surface display. Ferulic acid negatively affects both strains and it was the most toxic compound of the 8 compounds tested. In order to reduce the negative effects of these compounds, two commercial laccases were used. Besides, the biological effect of these compounds on the yeast membrane model was evaluated. Differential effects were observed on liposomes that are dependent on the phenolic compound tested, this assay was to probe the effect of phenolic compounds on yeast membrane. Once the effect on yeast cells was established, laccase treatment of phenolic compounds was performed to determine if enzymatic treatment reduces or increases the inhibitory effects of phenolic compounds on yeast. Laccase treatment of ferulic acid and vanillin reduces their negative effects increasing yeast growth and ethanol yield. While laccase treatment of syringic acid and p-coumaric acid showed a higher inhibitory effect than the untreated ones. For that reason, laccase detoxification is an appropriate strategy for hydrolysates that contain ferulic acid or vanillin as major compounds. Chapter III The results obtained in chapter II demonstrated that laccases can oxidize different types of phenolic compounds. Subsequently, laccase treatment of the rice husk hydrolysate was performed using a laccase displayed on S. cerevisiae surface, obtaining oxidation percentages between 1.7-7%. To solve the low oxidation, it was decided to test other laccases, as well as to increase the expression through directed evolution. Directed evolution of signal peptides allows to increase the expression of diverse proteins of interest, thus, based on this approach, directed evolution was performed on the Aga2 gene, which Summary xvii acts as signal peptide and anchor of yeast surface display system. Aga2 mutants increased up to 8 times the laccase production compared with the Aga2 wild type. Phenolic compounds were oxidized between 20-60% using these mutants. Until now, no reports were found in which mutations had been made in the anchor Aga2 to increase the expression of the protein fused to it. With this work, it was possible to show the flexibility of the anchor to be evolved and in this way improve the expression of proteins, without losing its anchoring capacity. Besides, some questions and drawbacks were solved to continue with the next step that is to evaluate the yeast/laccase system in real hydrolysate conditions.