Caracterización de la actividad tóxica de la RNA helicasa dependiente de ATP HrpB y del dominio glicosil-transferasa de la proteína PBP provenientes de la bacteria entomopatógena serratia entomophila Mor 4.1

Resumen En el estado de Morelos se aisló Serratia entomophila Mor 4.1, (SeMor4.1; Núñez-Valdez et al., 2008) que es una bacteria entomopatógena hacia larvas de Phyllophaga blanchardi (Coleoptera: Melolonthidae) y Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae). A partir de la subclona C8-F3 proveniente de la genoteca de SeMor4.1, se identificaron genes asociados a la toxicidad que codifican para el dominio glicosiltransferasa (GT) de una proteína de unión a penicilina 1b (PBP) y una RNA helicasa (RNA-HEL). El objetivo de este proyecto es caracterizar de manera independiente la actividad tóxica de las dos proteínas, la GT-PBP y la RNA-HEL, mediante bioensayos con larvas de Phyllophaga y/o S. frugiperda. Primeramente, se siguió una estrategia genética llevando a cabo la clonación con dos pasos principales para la expresión de ambos genes, los cuales primeramente se clonaron por separado (junto con sus regiones respectivas de promotor) en el vector de clonación pBluescript Sk+ (pSK). A partir de la clona C8-F3 y el vector pSK digeridos con las enzimas EcoRI y SmaI se obtuvo, después de la ligación, la construcción pSKHEL (5.6 Kpb); este plásmido se transformó en la cepa E. coli Epi 300™. Posteriormente, se evaluó la actividad tóxica de dicha construcción mediante bioensayos de inyección en Phyllophaga sp con sobrenadantes de cultivo libres de bacteria. Se observó que al día 7 del bioensayo la DL50 pSK-Hel fue de 18.661 μg/larva. Paralelamente se realizaron bioensayos de toxicidad con F3 y con pSK- GT-PBP (Clona E9) siendo la DL50 de 20.159 μg/larva para F3 y de 24.375 μg/larva para pSK- GT-PBP; los resultados sugieren que ambas proteínas presentan actividad tóxica de manera independiente. El siguiente paso, encaminado a la expresión de las proteínas, fue clonar sus genes en el vector de expresión pET-22b(+). El vector fue digerido con NotI/Eco53kI y, para la obtención del inserto, se utilizó la construcción previamente obtenida pTZ/SK-HEL que fue digerida con NotI y HincII, obteniéndose después de la ligación, la construcción pET-HEL de 7.9 Kpb en la cepa E. coli BL21. Para la clonación de GT-PBP en el sistema de expresión pET-22b (+) se obtuvo el inserto a partir del plásmido p31-GT-PBP; la digestión en el vector y el inserto se realizó con EcoRI y HindIII. Después de la ligación se obtuvo la construcción pET-GT-PBP de 6.8 Kpb, este plásmido se transformó en E. coli BL21. Se lograron avances en la expresión de GT-PBP y se determinó que el mayor rendimiento se obtiene a 25ºC con la adición de 0.5 mM IPTG, 24 h después de la inducción. En geles de poliacrilamida se observó una proteína purificada con el peso esperado de 54 kDa. Con respecto a la expresión de la RNA-Hel a partir de pET-HEL, se evaluaron diferentes condiciones para su expresión sin obtener resultados contundentes de expresión.