Actividad antihelmíntica in vitro de prosopis laevigata contra huevos y larvas infectantes de haemonchus contortus

RESUMEN El objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad antihelmíntica in vitro de un extracto hidroalcohólico y fracciones de la leguminosa Prosopis laevigata contra el nematodo de ovinos Haemonchus contortus, así como la purificación e identificación de al menos un constituyente químico responsable de la actividad nematicida. Se preparó una solución hidroalcohólica de Agua-MeOH (70:30) a partir de hojas de P. laevigata y, posteriormente, el extracto (E-HA) fue biparticionado con acetato de etilo (AcEt) para obtener dos fracciones: una acuosa (F-Aq) y otra orgánica (F-AcEt); los disolventes se eliminaron y finalmente se liofilizaron. El fraccionamiento químico de la F-AcEt se realizó por cromatografía de columna abierta y de capa fina (CCA-CCF) utilizando diferentes sistemas de elución. El tamizaje cualitativo fitoquímico del E-HA y F-Aq y F-AcEt se llevaron a cabo por técnicas de reacciones químicas colorimétricas. Se usaron micrografías a partir de una cámara ultra digital (AxioCam) acoplada a microscopía láser confocal, microscopía electrónica laser confocal (MELC) y microscopía electrónica de barrido ambiental (MEBA). Para el seguimiento en el aislamiento e identificación de los compuestos se usaron técnicas por análisis por HPLC (high-performance liquid chromatography), espectrometría de gases masas y RMN 1H 13C. Finalmente, el material biológico se obtuvo mediante técnicas coproparasitoscópicas usando un ovino donador de huevos del parásito H. contortus, previamente infectado con larvas infectantes (L3). La confrontación in vitro de huevos y larvas con el extracto hidroalcohólico (E-HA), fracciones (Aq y AcEt), subfracciones y compuestos se llevaron a cabo en placas de microtitulación de 96 pozos (n=4) a diferentes concentraciones. Se usaron controles negativos agua destilada y MeOH al 2% (prueba ovicida) y MeOH al 4% (prueba larvicida), además de ivermectina (0.5 mg/mL) como control positivo. Las lecturas se llevaron a cabo a las 48 h 2 (prueba ovicida) y 72 h (prueba larvicida) post-confrontación. Los resultados de las pruebas in vitro se analizaron bajo un diseño completamente al azar a través de un análisis ANOVA utilizando el modelo lineal general (GLM); se utilizó la prueba de Tukey para identificar diferencias significativas entre tratamientos utilizando el programa SAS. Los resultados mostrados por el E-HA en la prueba ovicida fueron cercanos al 100% a 25 mg/mL; mientras que la F-AcEt mostró un efecto letal ovicida del 100% a 0.75 mg/mL. En contraste la F-Aq no fue activa. Por otro lado, en la prueba del porcentaje de mortalidad (larvicida), el E-HA mostró un 85% de mortalidad a 150 mg/mL, mientras que la F-AcEt a 50 mg/mL exhibió una actividad larvicida del 96%; la F-Aq no mostró ninguna actividad. Los resultados de actividad larvicida de las subfracciones evaluadas in vitro contra larvas L3 fueron los siguientes: subfracción C1F1 a 15 mg/mL =79.47%; subfracción C2F1 a 7.5 mg/mL =100 %; subfracción C2F2 a 7.5 mg/mL= 100 % y con la subfracción C2F3 a 15 mg/mL =100%. Por otro lado, los compuestos como la luteolina y 4'-O-metilcatequina resultaron sin actividad ovicida, ni larvicida. Por otro lado, la mezcla que correspodía a luteolina e isoramnetina exhibió una elevada actividad ovicida del 96% a 0.15 mg/mL; en contraste, esta mezcla no registró actividad larvicida. Mientras tanto, la isoramnetina fue la responsable de una actividad nematicida del 100% contra huevos del parásito a una concentración de 0.07 mg/mL y contra larvas mostró una mortalidad del 100% a 7.5 mg/mL. El tamizaje fitoquímico del E-HA, F-Aq y F-AcEt reveló la presencia de alcaloides, flavonoides, taninos, terpenos/esteroles y saponinas. En tanto, el análisis por CLAR del extracto, fracciones y subfracciones y compuestos revelaron compuestos mayoritarios polares y de polaridad media correspondientes a compuestos fenólicos entre ellos al grupo de flavonoides. Por espectrometría de gases masas y RMN 1H y 13C se identificaron como luteolina, 4'-O-metilcatequina e isoramnetina. Las micrografías tomadas por una cámara digital de alta resolución AxioCam, MELC y MEBA, 3 revelaron daños internos en huevos y larvas del parásito atribuidos al compuesto. Los resultados de esta investigación demuestran que las hojas de la planta P. laevigata contiene un flavonoide llamado isoramnetina con actividad antihelmíntica in vitro contra H. contortus. Esta investigación es el primer informe detallado a nivel mundial acerca de la caracterización química de un flavonoide presente en hojas de la planta P. laevigata con actividad antiparasitaria in vitro, lo que podría ser una herramienta potencial prometedora contra la hemoncosis ovina.